Gis Oppervlak Vertoon Biblioteek Siftingsdiens

Alpha Lifetech spesialiseer in die konstruksie van gisvertoonbiblioteek en die sifting van teenliggaambiblioteke, en bied die vermoë om verskillende vorme van gisbiblioteke te genereer en dit te sif vir hoë affiniteit en spesifieke teenliggaampies vir kliënte wêreldwyd. Met 'n span kundige navorsers, gevorderde tegnologie en toerusting, kan ons gisbiblioteke bou wat op 'n wye reeks siekteverwante proteïene gemik is. Ons kan faagvertoning en gisvertoontegnologieë verskaf, insluitend proteïengisvertoning, kleinmolekule-gisvertoning, teenliggaamgisvertoning, ens.

Ons gisvertoonbiblioteke het groot kapasiteit en hoë diversiteit, wat 'n hoë fondament bied vir die effektiewe sifting van spesifieke teenliggaamvolgordes. Ons kan verskillende vorme van teenliggaam-gisvertoonbiblioteke (IgG, scFv, VHH, Fab-teenliggaambiblioteke), proteïenbiblioteke, peptiedbiblioteke, cDNA-biblioteke, ens. volgens u behoeftes konstrueer. Daarbenewens kan ons ook teenliggaambiblioteke van verskillende eienskappe ontwikkel, insluitend immuunbiblioteke, natuurlike biblioteke, sintetiese biblioteke, semi-sintetiese biblioteke en siekte-teenliggaambiblioteke.

Inleiding tot die gisvertoonstelsel

Gis-oppervlakvertoningstegnologie is 'n metode om rekombinante proteïene op die oppervlak van gis deur geenfusie te vertoon. Die mees algemene gisvertoningstelsel gebruik die teikenproteïen wat aan die C-terminus van die Aga2p-subeenheid van die alfa-lektien-paringsproteïen gekoppel is, hoofsaaklik bestaande uit epitoop-etikette aan beide kante van die teikenproteïen: die N-terminale 9-aminosuur hemagglutinien (HA)-etikett en die C-terminus 10 aminosuur c-myc-etikett. Die 69 aminosuur Aga2p-subeenheid bind aan die 725 aminosuur alfa-lektien Aga1p-subeenheid via twee disulfiedbindings, en Aga1p is aan die selwand geanker via 'n β 1,6-glukaan kovalente binding. Daarom word die teikenproteïen op die oppervlak van gisselle vertoon en vervolgens deur die ooreenstemmende ligand herken. Skei funksionele proteïene van biblioteke deur vloeisitometrie-sifting.

Fig 1: Beginsel van gisoppervlakvertoning. (Figuurbron: Toepassings van gisoppervlakvertoning vir proteïeningenieurswese.)

Inleiding tot die gisoppervlak-vertoningsbiblioteek

Gisvertoningssortering is gebaseer op gisoppervlakvertoning, hoofsaaklik gebruik om teenliggaambiblioteke wat seloppervlakproteïene teiken, te sif. As gevolg van die lae nie-spesifieke binding tussen gisselle en ander seloppervlakke, kan gisbiologiese seleksie groot bindingsbiblioteke sif om skaars klone te vind.

Gis Oppervlak Vertoon Biblioteek Siftingsdiens

Berei plasmiede voor en kweek gisselle, sintetiseer DNS wat vir die teikenproteïen kodeer en kloon dit in 'n gis-ekspressievektor wat induseerbare promotors, seinpeptiede en teikengene bevat wat met oppervlakvertoonproteïene (soos Aga2p) gefuseer is. Die geen wat vir die teikenproteïen kodeer, kan met die geen wat vir die gisselwandproteïen kodeer (gewoonlik Aga2p) gefuseer word, en die gefuseerde geen kan deur elektroporasie in gisselle getransformeer word. Na transformasie kan gisselle wat teenliggaamgene op hul oppervlak uitdruk, antigeen-spesifieke siftingstoetse ondergaan: die gisbiblioteek word met die teikenantigeen geïnkubeer en gisselle wat spesifiek daaraan bind, word geselekteer. Deur fluoresensie-geaktiveerde selsortering (FACS) te gebruik om gisselle wat proteïene met verlangde eienskappe vertoon, te isoleer, kan gisvertoonbiblioteeksifting uitgevoer word met 'n maksimum biblioteekgrootte van ~10 ^ 8-10 ^ 9 gisselle. Positiewe klone kan dan geïsoleer word vir verdere analise of stroomaf toepassings. Sodra spesifieke teenliggaamklone uit die teenliggaambiblioteek geïdentifiseer is, kan hulle verder gekarakteriseer en massa-geproduseer word, en gesuiwer word met behulp van tegnieke soos proteïen A/G-affiniteitschromatografie om die hele proses van gisvertoonsifting en teenliggaamproduksie te voltooi.

Proses van gis-uitstallingsbiblioteek-sifting

Fig.2 Siftingsproses vir gisvertoningsbiblioteek

Gis Vertoonbiblioteek Siftingsdiens Werkvloei

Stappe	Diensinhoud	Tydlyn
Antigeenvoorbereiding	Antigeentipe: Indien die kliënt antigene kan verskaf, moet ooreenstemmende monsters volgens die tipe afgelewer word: rekombinante proteïene benodig 3-3.5 mg met 'n suiwerheidsvereiste van meer as 85%, klein molekules moet gekonjugeer word met 'n suiwerheidsvereiste van meer as 90%, peptiedsintese moet gekonjugeer word met 'n suiwerheidsvereiste van meer as 90%, monstertipes soos virusse moet geïnaktiveer word, RNA moet geïnspekteer word om degradasie te voorkom, en die bogenoemde antigeentipes kan ook aangepas word vir sintese.	2-3 weke
Diere-immuniteit	Die aantal diere-immuniserings is 5, en dit is nodig om te bepaal of die aantal immuniserings verhoog moet word op grond van serumtitertoetsing. Antigeenimmuniteit: proteïen/virus-antigeen-sterkte > 105; Peptied/kleinmolekule-antigeen-sterkte > 10^4	5-6 weke
Sjabloon cDNA Voorbereiding	Skei plasma PBMC's, ekstraheer totale RNA (RNA-ekstraksiekit) en keer om na cDNA.	1 dag
Biblioteekkonstruksie	Deur biblioteek-cDNA as 'n sjabloon te gebruik, is die VHH-geen geamplifiseer deur twee rondes PCR, en die VHH-geensplitsingsgisvertoonvektor is gekonstrueer. Die vektor is deur elektroporasie in gisselle getransformeer om 'n teenliggaambiblioteek te konstrueer. Kies lukraak 48 klone en identifiseer die positiewe tempo (>90%) met behulp van die PCR-metode; Bereken biblioteekkapasiteit (10^7-10^8), NGS-volgordebepaling om die korrekte biblioteekinvoegingstempo (>90%) en biblioteekdiversiteit te bepaal.	2 weke
Biblioteekvertoning	Standaard drie rondes van sifting: Fluoresensie-gemerkte proteïen FACS-sifting, gevolg deur NGS-volgordebepaling in die derde ronde. Positiewe klone is geselekteer vir enkelgram-induksie-ekspressie en ELISA-deteksie. Alle positiewe klone is geselekteer vir geenvolgordebepaling, en verskillende CDR-streekvolgordes is geselekteer.	2-3 weke
Teenliggaamverifikasie	Die konstruksie van gepaste ekspressievektore vir teenliggaamreekse kan teenliggaam-ekspressie, teenliggaamsuiwering, ELISA- en BLI-validering van teenliggaam-antigeenbinding om teenliggaam-affiniteit te verifieer, en vloeisitometrie-blokkade om selfunksie te valideer, fasiliteer.	1 week

Geval van Gis Oppervlak Vertoon Biblioteek Sifting

In die literatuur van die gis-oppervlakvertoningsplatform vir die vinnige ontdekking van konformasioneel selektiewe nanoliggaamtjies, het die outeurs 'n volledige in vitro-nanoliggaam-ontdekkingsplatform gebaseer op gis-oppervlakvertoning gevestig. Eerstens is 'n sintetiese nanoliggaambiblioteek ontwerp vanaf kameelgene. Figuur D toon dat die nanoliggaam 'n HA-etiket aan die karboksiel-punt het, en dan word die nanoliggaam kovalent aan die gisselwand vasgemaak. Figuur E toon die nanoliggaam-siftingsproses. Gis met antigeen-affiniteits-nanoliggaamtjies is geïsoleer, versterk en herhaaldelik vir teenliggaampies geselekteer deur FACS. Die outeurs het konformasioneel selektiewe nanoliggaamtjies ontdek wat twee verskillende menslike GPCR's deur hierdie platform teiken.