Услуга за разработване на моноклонални антитела

Alpha Lifetech може да осигури предсказване на епитопи, синтез на пептиди, експресия на протеини, производство на поликлонални или моноклонални антитела, както и пречистване на антитела от клетъчна култура, асцитна течност или цял серум.

СВЪРЖЕТЕ СЕ С НАС

Услуга за разработване на моноклонални антитела

Алфа Лайфтех Инк.може да осигури предсказване на епитопи, пептиден синтез, протеинова експресия, производство на поликлонални или моноклонални антитела, както и пречистване на антитела от клетъчна култура, асцитна течност или цял серум.

Алфа Лайфтех Инк.има опит в предоставянето на различни услуги за стабилни клетъчни линии на клиенти, включително хибридомни клетки, клетъчни линии за редактиране на геном, клетъчни линии с нокаут и клетъчни линии с свръхекспресия. Стараем се да предлагаме на всеки клиент усъвършенствани услуги за персонализирани клетъчни линии, а нашите услуги са доказани и надеждни.

Стратегия за разработване на антитела

1. Дизайн и подготовка на антигени
Тези антигени могат да бъдат протеини, пептиди или други молекули. Проектирането на имуногени изисква цялостен подход, който интегрира познания за структурата на антигена, имунологията и системите за доставяне. Alpha Lifetech разполага с технология за проектиране на антигени, която може да проектира имуногени за нуждаещи се клиенти.
Alpha Lifetech предоставя на клиентите си продукти от рекомбинантни протеини, от които да избират. Разполагаме с разнообразие от системи за експресия на протеини, като например система за експресия на E. coli, система за експресия на дрожди, система за експресия на бакуловирус-насекоми, система за експресия на бозайници и др., за да произведем рекомбинантните протеини, от които се нуждаете за изследвания.

2. Имунизация на животни
Alpha Lifetech може да предостави имуногени на клиентите си, като на ваше разположение са имунизирани животни като мишки, зайци, овце, алпаки, морски свинчета, хамстери и др.

3. Методи за производство на моноклонални антитела

●Производство на моноклонални антитела (МАБ) чрез хибридомна технология
Хибридомът е хибридна клетка, получена чрез сливане на два вида клетки, а именно клетъчна линия на миши миелом и плазмени клетки (лимфоцит B), при която хетерозиготната клетка може да произвежда непрекъснати антитела срещу интересуващия ни антиген in vitro. Производството на хибридомна клетъчна линия се състои от три части: антигенен дизайн (хаптени, малки молекули и пептиди), имунизация на животни, клетъчно сливане и скрининг на положителни клонове. Използвайки уникални методологии за имунизация, ние постигаме изключително висока ефективност на клетъчното сливане (1-10 хибридома на хиляда B клетки) и високи титри на антитела, което максимизира процента ни на успех в последващи аналитични тестове, които включват биохимичен скрининг, in vitro клетъчни анализи и изследвания върху животни.

●Производство на моноклонални антитела чрез технология на фагов дисплей
Фаговият дисплей предлага друг метод за генериране на моноклонални антитела. В-лимфоцитите се изолират от животинска кръв и тяхната иРНК се екстрахира. Чрез PCR тази иРНК се превръща в кДНК, която амплифицира всички VH и VL сегменти. След това тези сегменти се клонират във вектор, обикновено като едноверижни вариабилни фрагменти (scFv), заедно с PIII протеина на бактериофага. Впоследствие тази конструкция се използва за инфектиране на E. coli, което води до създаването на библиотека, съдържаща приблизително 10^10 клетки чрез инокулация с помощен фаг. След това E. coli е в състояние да секретира бактериофага, съдържащ VH и VL сегментите като част от своята обвивка. След това могат да бъдат избрани специфични VH и VL сегменти, насочени към интересуващия ни антиген, и използвани за реинокулиране на E. coli с бактериофага. Клетките, съдържащи плазмида, след това се изолират и секвенират.

4. Скрининг за сливане

●Клетъчно сливане и селекция
Събраните В-клетки след това се сливат с миеломни клетки, които са ракови клетки, които могат да се размножават неограничено в култура. Сливането обикновено се постига с помощта на техника като сливане с полиетиленгликол (PEG).
След сливането, хибридомните клетки се култивират в селективна среда, която позволява само на хибридомите да оцелеят. Средата обикновено съдържа аминоптерин, който предотвратява растежа на неслети миеломни клетки.

●Скрининг и клонинг
Получените хибридомни клетки се скринират за производство на антитела, специфични за целевия антиген. Това обикновено се прави с помощта на техники като ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA), Western blot, имунопреципитация и флуоцитометрия.

След като хибридомните клетки, произвеждащи антитялото, бъдат идентифицирани, те се клонират, за да се генерира популация от идентични клетки. Това гарантира, че антитялото, произведено от всяка хибридомна клетка, е идентично.

5. Проверка на функцията на антителата
Alpha Lifetech предоставя функционално валидиране на антитела, като Western blotting, имунохистохимия или функционални анализи, за да характеризира моноклоналните антитела и да потвърди специфичността, афинитета и функционалността на антителата.

6. Оптимизация на антителата
Пречистване на антитела от културална супернатанта с помощта на техники като афинитетна хроматография на протеин А или протеин G, а Alpha Lifetech може също да предостави методи за модификация на антитела за подобряване на афинитета на антителата.

7. Производство на антитела
Alpha Lifetech може да оцени кандидат-антитела за високопроизводителни скринингови приложения и мащабно производство.

често задавани въпросичесто задавани въпроси

Често задавани въпроси за разработването на моноклонални антитела

1

Как да изберем правилния хибридом за сливане?

По време на процеса на сливане, 10-15 96-ямкови микротитърни плаки се посяват със сместа от хибридни съединения. Всяка плака се захранва със селекционна среда HAT-IMDM и се държи в инкубатор с въглероден диоксид при 37 градуса по Целзий. 9-14 дни след сливането, хибридните супернатанти се тестват за наличие на специфичното антитяло, което ни интересува.
2

Как да се подобри ефективността на селекцията?

Сливането на плазматични клетки с техните миеломни аналози не е 100% ефективно. Дори при оптимални условия и най-ефективната стимулация, клетъчното сливане все още произвежда смес от несливащи се и сливащи се клетки, които трябва да бъдат разделени. За да се подобри ефективността на процеса на селекция, миеломните клетки, използвани за сливане, нямат HGPRT, ключов ензим в пътя на възстановяване на нуклеотидите. След това сместа е култивирана в HAT среда, където само клетки с ензима HGPRT, хибридоми, наследили HGPRT от плазматични клетки, са жизнеспособни.
3

Как да се скринират хибридомни клетъчни линии за активност на антитела?

Оценката на хибридните сортове е ключова стъпка. Обикновено скринингът на супернатанта на хибридоми, клонове и субклонове се извършва чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA), Western blot анализ и сортиране на флуоресцентно активирани клетки (FACS). Ще изберем да проведем целия скрининг на супернатанта в нашата собствена лаборатория.
4

Дайте подробни инструкции как да се проведе скрининг за активност на антитела?

Хибридомните супернатанти, които ще бъдат тествани, могат да варират от 500 до 1440 проби и ще бъдат готови за тестване от 9 до 14 ден. Може да се случи в рамките на три до пет дни или всички проби може да са готови в един и същи ден, така че е важно клиентската лаборатория да е подготвена седмици предварително с работещи специфични вторични скринингови тестове по избор.
5

Защо е необходимо субклонирането на позитивни хибридоми?

След като положителните ямки бяха идентифицирани по време на първоначалната ELISA скрининг процедура, хибридомите бяха прехвърлени в по-голям обем, т.е. 24-ямкови плаки, в подготовка за процедурата по субклониране. Субклонирането на хибридоми обикновено се извършва чрез метод на ограничено разреждане, за да се гарантира изолирането на стабилни моноклони. Техниката включва разреждане на хибридомни култури и диспергирането им в 96-ямкови плаки, за да се постигне моноклоналност (една клетка на ямка). Трябва да се извършат поне две ограничени разреждания, за да се намали рискът от развитие на смесени хибридомни популации.
6

Какви са ползите от използването на хибридомна технология за откриване на антитела?

Хибридните клетъчни линии са хвалени за способността си да произвеждат антитела с висок афинитет, стабилност и специфичност по най-рентабилния начин.