Услуга за скрининг на библиотека за повърхностно показване на мая

Alpha Lifetech е специализирана в изграждането на библиотеки за показване на дрожди и скрининга на библиотеки с антитела, предлагайки възможност за генериране на различни форми на библиотеки с дрожди и скринингът им за високоафинитетни и специфични антитела за клиенти по целия свят. С екип от експертни изследователи, съвременни технологии и оборудване, ние можем да изградим библиотеки с дрожди, насочени към широк спектър от протеини, свързани със заболявания. Можем да предоставим технологии за фагов дисплей и показване на дрожди, включително показване на протеини от дрожди, показване на малки молекули от дрожди, показване на антитела от дрожди и др.

Нашите библиотеки за показване на дрожди имат голям капацитет и високо разнообразие, което осигурява солидна основа за ефективен скрининг на специфични антителни последователности. Можем да конструираме различни форми на библиотеки за показване на дрожди с антитела (IgG, scFv, VHH, Fab антителни библиотеки), протеинови библиотеки, пептидни библиотеки, кДНК библиотеки и др. според вашите нужди. Освен това можем да разработим и библиотеки с антитела с различни свойства, включително имунни библиотеки, естествени библиотеки, синтетични библиотеки, полусинтетични библиотеки и библиотеки с антитела срещу болести.

Въведение в системата за показване на мая

Технологията за показване на повърхността на дрождите е метод за показване на рекомбинантни протеини върху повърхността на дрождите чрез генно сливане. Най-разпространената система за показване на дрожди използва целевия протеин, свързан с C-края на Aga2p субединицата на алфа лектиновия чифтосващ протеин, състоящ се главно от епитопни маркери от двете страни на целевия протеин: N-терминален 9-аминокиселинен хемаглутининов (HA) маркер и C-терминален 10-аминокиселинен c-myc маркер. 69-аминокиселинен Aga2p субединичен елемент се свързва със 725-аминокиселинен алфа лектинов Aga1p субединичен елемент чрез две дисулфидни връзки, а Aga1p е закотвен към клетъчната стена чрез ковалентна връзка β 1,6-глюкан. Следователно, целевият протеин се показва на повърхността на дрождевите клетки и впоследствие се разпознава от съответния лиганд. Разделете функционалните протеини от библиотеките чрез скрининг с флоуцитометрия.

Фиг. 1: Принцип на показване на повърхността на дрождите. (Източник на фигурата: Приложения на дисплея на повърхността на дрождите за протеиново инженерство.)

Въведение в библиотеката за показване на повърхности на мая

Сортирането на дрождеви дисплеи се основава на дисплей на повърхността на дрождите, използван главно за скрининг на библиотеки с антитела, насочени към протеини на клетъчната повърхност. Поради ниското неспецифично свързване между дрождевите клетки и други клетъчни повърхности, биологичната селекция на дрождите може да скринира големи библиотеки с свързващи вещества, за да открие редки клонове.

Услуга за скрининг на библиотека за повърхностно показване на мая

Пригответе плазмиди и култивирайте дрождеви клетки, синтезирайте ДНК, кодираща целевия протеин, и я клонирайте в дрождев експресионен вектор, съдържащ индуцируеми промотори, сигнални пептиди и целеви гени, слети с повърхностни дисплейни протеини (като Aga2p). Генът, кодиращ целевия протеин, може да бъде слят с гена, кодиращ протеина на клетъчната стена на дрождите (обикновено Aga2p), и слетият ген може да бъде трансформиран в дрождеви клетки чрез електропорация. След трансформацията, дрождевите клетки, експресиращи гени на антитела на повърхността си, могат да преминат през антиген-специфични скринингови тестове: дрождевата библиотека се инкубира с целевия антиген и дрождеви клетки, които се свързват специфично с него, се селектират. Използвайки флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS) за изолиране на дрождеви клетки, показващи протеини с желани характеристики, може да се извърши скрининг на дрождева дисплейна библиотека с максимален размер на библиотеката от ~10^8-10^9 дрождеви клетки. След това положителните клонинги могат да бъдат изолирани за по-нататъшен анализ или последващи приложения. След като специфични клонинги на антитела бъдат идентифицирани от антитяловата библиотека, те могат да бъдат допълнително характеризирани и масово произведени, и пречистени с помощта на техники като афинитетна хроматография на протеин A/G, за да се завърши целият процес на скрининг на дрождева дисплея и производство на антитела.

Процес на скрининг на библиотеката с дрожди

Фиг. 2 Процес на скрининг на библиотека за показване на дрожди

Работен процес на услугата за скрининг на библиотека с мая

Стъпки	Съдържание на услугата	Хронология
Приготвяне на антиген	Вид антиген: Ако клиентът може да предостави антигени, съответните проби трябва да бъдат доставени според вида: рекомбинантните протеини изискват 3-3,5 mg с изискване за чистота над 85%, малките молекули трябва да бъдат конюгирани с изискване за чистота над 90%, пептидният синтез трябва да бъде конюгиран с изискване за чистота над 90%, видовете проби като вируси трябва да бъдат инактивирани, РНК трябва да бъде инспектирана, за да се предотврати разграждането, а горните видове антигени могат да бъдат персонализирани за синтез.	2-3 седмици
Имунитет на животните	Броят на имунизациите на животните е 5 и е необходимо да се определи дали да се увеличи броят на имунизациите въз основа на изследване на серумния титър. Антигенен имунитет: активност на протеинов/вирусен антиген > 105; активност на пептиден/малкомолекулен антиген > 10^4	5-6 седмици
Приготвяне на шаблонна кДНК	Разделете плазмените PBMC, екстрахирайте тоталната РНК (комплект за екстракция на РНК) и я превърнете в кДНК.	1 ден
Строителство на библиотеки	Използвайки библиотечна кДНК като шаблон, VHH генът беше амплифициран чрез два кръга PCR и беше конструиран VHH генно-сплайсиращ дрождев дисплей вектор. Векторът беше трансформиран в дрождеви клетки чрез електропорация, за да се конструира библиотека с антитела. Случайно избрани 48 клона и идентифициран процент на положителни резултати (>90%), използвайки PCR метод; Изчислен капацитет на библиотеката (10^7-10^8), NGS секвениране, за да се определи правилният процент на вмъкване на библиотеката (>90%) и разнообразието на библиотеката.	2 седмици
Прожекция в библиотеката	Три кръга на скрининг по подразбиране: FACS скрининг на флуоресцентно белязан протеин, последван от NGS секвениране в третия кръг. Положителните клонове бяха избрани за индукционна експресия в един грам и ELISA детекция. Всички положителни клонове бяха избрани за генно секвениране и бяха избрани различни CDR регионални последователности.	2-3 седмици
Проверка на антитела	Конструирането на подходящи експресионни вектори за антителни последователности може да улесни експресията на антитела, пречистването на антитела, ELISA и BLI валидирането на свързването на антитела с антиген за проверка на афинитета на антителата и блокадата на флоуцитометрията за валидиране на клетъчната функция.	1 седмица

Случай на скрининг на библиотека с повърхностен дисплей на дрожди

В литературата за платформа за повърхностен дисплей на дрожди за бързо откриване на конформационно селективни нанотела, авторите са създали цялостна in vitro платформа за откриване на нанотела, базирана на повърхностен дисплей на дрожди. Първо, е проектирана библиотека от синтетични нанотела, започвайки от камилски гени. Фигура D показва, че нанотялото има HA маркер в карбоксилния край, след което нанотялото е ковалентно фиксирано върху клетъчната стена на дрождите. Фигура E показва процеса на скрининг на нанотела. Дрожди с антигенно афинитетни нанотела са изолирани, амплифицирани и многократно селектирани за антитела чрез FACS. Авторите са открили конформационно селективни нанотела, насочени към два различни човешки GPCR, чрез тази платформа.