Šta je inženjering antitijela?

Uz pomoć inženjeringa antitijela, moguće je modificirati molekularnu veličinu, farmakokinetiku, imunogenost, afinitet vezivanja, specifičnost i efektorsku funkciju antitijela. Nakon sinteze antitijela, specifično vezivanje antitijela čini ih vrlo vrijednim u kliničkoj dijagnozi i liječenju. Kroz inženjering antitijela, ona mogu zadovoljiti potrebe ranog razvoja lijekova i dijagnostike.

Svrha inženjeringa antitijela je dizajniranje i proizvodnja visoko specifičnih, stabilnih funkcija koje prirodna antitijela ne mogu postići, postavljajući temelje za proizvodnju terapijskih antitijela.

Alpha Lifetech, sa svojim bogatim iskustvom u projektima inženjeringa antitijela, može pružiti prilagođene usluge monoklonskih i poliklonskih antitijela za više vrsta, kao i usluge konstrukcije i skrininga biblioteka antitijela za fagni prikaz. Alpha Lifetech može pružiti kupcima kvalitetna biosimilarna antitijela i rekombinantne proteinske proizvode, kao i odgovarajuće usluge, za proizvodnju efikasnih, visoko specifičnih i stabilnih antitijela. Korištenjem sveobuhvatnih platformi za antitijela, proteine ​​i sisteme za fagni prikaz, pružamo usluge koje pokrivaju uzvodno i nizvodno od proizvodnje antitijela, uključujući tehničke usluge kao što su humanizacija antitijela, prečišćavanje antitijela, sekvenciranje antitijela i validacija antitijela.

Pionirska faza inženjeringa antitijela povezana je s dvije tehnologije:

--Tehnologija rekombinantne DNK

--Hibridomska tehnologija

Brzi razvoj inženjerstva antitijela povezan je s tri važne tehnologije:

--Tehnologija kloniranja gena i lančana reakcija polimeraze

--Ekspresija proteina: Rekombinantni proteini se proizvode pomoću ekspresijskih sistema kao što su kvasac, štapićasti virusi i biljke

--Računalno podržano strukturno projektovanje

Prva generacija antitijela je humanizirana za proizvodnju himernih antitijela, gdje je varijabilna regija mišjih monoklonskih antitijela bila povezana s konstantnom regijom molekula ljudskog IgG. Regija za vezivanje antigena (CDR) mišjeg monoklonskog antitijela druge generacije transplantirana je u ljudski IgG. Osim CDR regije, sva ostala antitijela su gotovo ljudska antitijela, a uloženi su napori da se izbjegne induciranje odgovora ljudskih antimišjih antitijela (HAMA) kada se koriste mišja klonirana antitijela za liječenje ljudi.

 

Da bi se konstruirala biblioteka fagnog prikaza, prvi korak je dobijanje gena koji kodiraju antitijela, koja se mogu izolirati iz B ćelija imuniziranih životinja (konstrukcija imunološke biblioteke), ekstrahirati direktno iz neimuniziranih životinja (konstrukcija prirodne biblioteke) ili čak sastaviti in vitro s fragmentima gena antitijela (sintetička konstrukcija biblioteke). Zatim se geni amplificiraju PCR-om, ubacuju u plazmide i eksprimiraju u odgovarajućim sistemima domaćina (ekspresija kvasca (obično Pichia pastoris), prokariotska ekspresija (obično E. coli), ekspresija ćelija sisara, ekspresija biljnih ćelija i ekspresija ćelija insekata zaraženih virusima u obliku štapića). Najčešći je ekspresijski sistem E. coli, koji integrira specifičnu kodirajuću sekvencu antitijela na fag i kodira jedan od proteina ljuske faga (pIII ili pVIII). Fuzija gena, I prikazana je na površini bakteriofaga. Suština ove tehnologije je konstrukcija biblioteke fagnog prikaza, koja ima prednost u odnosu na prirodne biblioteke po tome što može imati specifično vezivanje. Nakon toga, antitijela sa antigenskom specifičnošću se probiru kroz proces biološke selekcije, ciljni antigeni se fiksiraju, nevezani fagi se više puta ispiru, a vezani fagi se ispiru radi daljnjeg obogaćivanja. Nakon tri ili više krugova ponavljanja, izoliraju se antitijela visoke specifičnosti i visokog afiniteta.

Slika 3: Konstrukcija i skrining biblioteke antitijela

Tehnologija rekombinantne DNK može se koristiti za generiranje fragmenata antitijela. Fab antitijela se u početku mogu hidrolizirati samo želučanom proteazom kako bi se proizveli (Fab')2 fragmenti, koje zatim papain probavlja kako bi se generirali pojedinačni Fab fragmenti. Fv fragment se sastoji od VH i VL, koji imaju slabu stabilnost zbog odsustva disulfidnih veza. Stoga su VH i VL povezani kratkim peptidom od 15-20 aminokiselina kako bi formirali antitijelo s jednim lancem varijabilnog fragmenta (scFv) s molekularnom težinom od približno 25 KDa.

Proučavanje strukture antitijela kod porodica Camelidae (Camel, Liama ​​i Alpaca) razjasnilo je da antitijela imaju samo teške lance, a ne i lake lance, stoga se nazivaju antitijela teškog lanca (hcAb). Varijabilni domen antitijela teškog lanca naziva se antitijela s jednim domenom ili nanotijela ili VHH, veličine 12-15 kDa. Kao monomeri, nemaju disulfidne veze i vrlo su stabilni, s vrlo visokim afinitetom za antigene.

Slika 5: Antitijelo teškog lanca i VHH/nanotijelo

Slobodna ekspresija koristi ekspresiju prirodne ili sintetičke DNK za postizanje in vitro sinteze proteina, obično korištenjem sistema ekspresije E. coli. Brzo proizvodi proteine ​​i izbjegava metaboličko i citotoksično opterećenje ćelija prilikom proizvodnje velikih količina rekombinantnih proteina in vivo. Također može proizvesti proteine ​​koje je teško sintetizirati, poput onih koje je teško modificirati nakon translacije ili sintetizirati membranske proteine.