Usluga analize karakterizacije aptamera

Alpha Lifetech već dugi niz godina pruža usluge vezane za aptamere i trenutno može pružiti sveobuhvatne sheme razvoja aptamera kao što su sinteza aptamera, SELEX skrining, sekvenciranje visokog protoka te optimizacija i karakterizacija aptamera. Na osnovu prednosti SELEX metode za skrining aptamera, Alpha Lifetech je proširio više metoda za skrining aptamera.

Uvod u analizu karakterizacije aptamera

Verifikacija afiniteta

Optimizirani afinitet aptamera provjeren je relevantnim tehnikama testa vezivanja aptamera. Primjeri uključuju izotermnu titracijsku kalorimetriju (ITC), protočnu citometriju (FCM) i površinsku plazmonsku rezonancu (SPR), mikrofluidiku itd. Afinitet aptamera se obično izražava konstantom disocijacije (KD), fizičkom veličinom koja se koristi za kvantificiranje stepena molekularne disocijacije u reverzibilnoj reakciji. Što je manja vrijednost KD, to je kompleks stabilniji, odnosno afinitet je jači; obrnuto, što je veća vrijednost KD, to je kompleks nestabilniji i afinitet je slabiji. Ovaj korak je ključan za identifikaciju performansi aptamera, osiguravajući sazrijevanje afiniteta aptamera i mogućnost vezivanja za ciljnu molekulu s visokim afinitetom i selektivnošću u praktičnim primjenama.

Sl.1 Proces sazrijevanja afiniteta aptamera. Izvor reference:Kinghorn AB, Fraser LA, 2017.

Verifikacija funkcije

Pored verifikacije afiniteta, potrebno je verificirati i funkciju aptamera. To uključuje verifikaciju stabilnosti, specifičnosti i interakcija aptamera s drugim molekulama u određenom okruženju. Rezultati funkcionalne verifikacije će direktno uticati na vrijednost aptamera u naučnim istraživanjima i industrijskim primjenama.

Specifična verifikacija

Kompetitivni eksperiment: Sposobnost aptamera da se veže za specifičnu metu procjenjuje se u prisustvu drugih sličnih meta. Ako se aptamer može specifično vezati za ciljnu molekulu bez interferencije od drugih molekula, to ukazuje na njegovu visoku specifičnost.

Eksperiment unakrsne reakcije: Aptamer se veže za niz srodnih ili nepovezanih ciljeva kako bi se utvrdilo da li se veže samo za određeni cilj, te na taj način potvrdila njegova specifičnost.

Verifikacija stabilnosti

Eksperiment degradacije nukleaza: Aptameri su bili izloženi različitim koncentracijama nukleaza i uočena je njihova degradacija. Poređenjem stepena degradacije u različitim vremenskim tačkama, može se procijeniti sposobnost aptamera da razgradi antinukleaze.

Eksperiment temperaturne i vremenske stabilnosti: Aptamer je stavljen pod različite temperaturne i vremenske uslove kako bi se posmatrala njegova strukturna i funkcionalna stabilnost. Ovo pomaže u određivanju optimalnih uslova skladištenja i upotrebe aptamera.

Identifikacija biološke aktivnosti

Odgovarajuća metoda se obično bira prema specifičnom cilju primjene nukleinsko-kiselinskog aptamera.

(1) Testiranje na molekularnom nivou: Korištenje tehnika molekularne biologije, kao što su gel elektroforeza, Western blot itd., za detekciju kompleksa nastalih nakon što se aptamer kombinuje sa ciljnom molekulom ili za detekciju promjena u nivou ekspresije ciljne molekule uzrokovane aptamerom.

(2) Testiranje na nivou ćelija: Korištenjem tehnologije kulture ćelija, aptameri se inkubiraju sa ciljnim ćelijama kako bi se posmatrale biološke promjene poput morfologije ćelija, proliferacije i apoptoze, te procijenila biološka aktivnost aptamera.

(3) Testiranje na životinjskim modelima: U odgovarajućim životinjskim modelima, aptameri nukleinskih kiselina se daju injekcijom ili primjenom lijekova, a fiziološki indikatori i patološke promjene kod životinja se posmatraju kako bi se procijenila biološka aktivnost i sigurnost aptamera in vivo.