Platforma za razvoj bispecifičnih antitijela

Alpha Lifetech može pružiti kupcima kvalitetne proizvode i usluge za otkrivanje antitijela i rekombinantnih proteina. Možemo pripremiti antitijela s visokom efikasnošću, jakom specifičnošću i dobrom stabilnošću. Alpha Lifetech ima niz instrumenata i opreme za prečišćavanje antitijela, koji mogu pružiti usluge prečišćavanja antitijela iz različitih izvora kao što su monoklonska antitijela zeca, ovaca, pilića i miševa, kao i usluge afinitetnog prečišćavanja proteina A/G te usluge odvajanja i prečišćavanja antitijela. Na osnovu sveobuhvatne konstrukcije sistema platforme za otkrivanje antitijela, proteinske platforme itd., pokrivamo uzvodne i nizvodne usluge proizvodnje antitijela i možemo pružiti tehničke usluge od pripreme antitijela, prečišćavanja bispecifičnih antitijela i odvajanja i prečišćavanja antitijela, sekvenciranja antitijela, validacije antitijela itd., koje se mogu koristiti za terapiju bispecifičnim antitijelima.

Monoklonska antitijela odnose se na imunoglobuline koje proizvodi jedna B ćelija, a koje imaju visoku specifičnost za antigene ili epitope. Proizvodnja monoklonskih antitijela prvobitno je pripremljena korištenjem hibridomske tehnologije za proizvodnju mišjih antitijela. Konkretno, spajanjem ćelija slezene imuniziranih miševa sa ćelijama mijeloma ljudi ili miševa, formiraju se hibridomske ćelije koje luče specifična antitijela. Generirana mišja monoklonska antitijela uglavnom se koriste u istraživanjima životinja i dijagnostici bolesti nakon usluga prečišćavanja. Međutim, ljudsko tijelo će proizvesti imunološki odgovor na strane mišje proteine, tako da postoje značajna ograničenja u kliničkoj primjeni proizvodnje mišjih monoklonskih antitijela. Kasnije su ljudi koristili "humanizaciju" za pripremu monoklonskih antitijela od miševa i koristili tehnologiju genetskog inženjeringa za modificiranje mišjih antitijela kako bi imali konstantnu regiju ljudskog imunoglobulina kako bi smanjili njihovu imunogenost. Ova vrsta antitijela poznata je i kao humanizirano monoklonsko antitijelo. Osim toga, korištenje ljudskih ćelija za proizvodnju monoklonskih antitijela naziva se priprema cijelog ljudskog monoklonskog antitijela. Monoklonska antitijela se široko koriste u biomedicinskim i kliničkim primjenama. U medicinskim istraživanjima, monoklonska antitijela mogu se koristiti kao imunomodulatori, terapijska monoklonska antitijela mogu se koristiti za hemoterapiju raka i liječenje virusnih infekcija, a razvoj konjugata monoklonskih antitijela uglavnom se koristi za liječenje raka.

Uvod u bispecifična antitijela

Koncept bispecifičnih antitijela predložen je 1960. godine. Bispecifična antitijela, poznata i kao bispecifična monoklonska antitijela, su vještački sintetizirana antitijela korištenjem tehnologije genetskog inženjeringa. Kao konstruirana vještačka antitijela, bispecifična antitijela obično pripadaju IgG podklasi i sadrže fragment koji veže antigen i cilja CD3 podjedinicu. Bispecifična antitijela imaju dva specifična mjesta vezivanja antigena koja mogu istovremeno vezati i prepoznati dva različita antigena ili dva različita epitopa antigena. U poređenju s monoklonskim antitijelima, bispecifična antitijela imaju dodatno specifično mjesto vezivanja antigena, te stoga posjeduju jaču specifičnost i sposobnost ciljanja, što im omogućava preciznije ciljanje tumorskih ćelija i smanjenje toksičnosti izvan cilja. Bispecifična antitijela mogu istovremeno obavljati više bioloških funkcija, kao što su regrutovanje imunih ćelija, blokiranje signalnih puteva i direktno ubijanje tumorskih ćelija. Rana bispecifična antitijela uglavnom su se pripremala hemijskom konjugacijom ili fuzijom ćelija, ali ova metoda je možda sporo napredovala zbog slučajne kombinacije i poteškoća u izolaciji ciljne kombinacije. Kontinuiranim razvojem tehnologije genetskog inženjeringa, razvijene su mnoge nove tehnološke platforme, kao što su čvorovi u rupama (KIH), CrossMab, DVD Ig itd. Ove platforme efikasno rješavaju probleme poput neusklađenosti teških i lakih lanaca, te poboljšavaju ujednačenost i prinos bispecifičnih antitijela.

Sl. 1 Pojednostavljeni shematski pregled predloženih mehanizama djelovanja bispecifičnih antitijela (bsAbs) u kliničkim ispitivanjima za onkologiju.(Izvor slike: Pregled bispecifičnih antitijela i konstrukata antitijela u onkologiji i kliničkim izazovima - ScienceDirect)

Tehnologija proizvodnje bispecifičnih antitijela

Glavne metode za proizvodnju bispecifičnih antitijela uključuju hemijsko spajanje, hibridom s četiri izvora i pripremu antitijela genetskim inženjeringom. Među njima, metoda hemijskog spajanja spaja dva intaktna IgG ili dva F(ab')2 fragmenta antitijela u bispecifična antitijela korištenjem hemijskih sredstava za spajanje kao što su ftalimid i ditioacilbenzojeva kiselina. Ova metoda je jednostavna i laka za primjenu, ali može oštetiti mjesto vezivanja antigena, smanjiti aktivnost antitijela, a samo sredstvo za spajanje također ima određeni stepen kancerogenosti. Metoda hibridoma s četiri izvora zasniva se na fuziji somatskih ćelija iz dvije različite ćelijske linije hibridoma kako bi se eksprimirao odgovarajući mišji IgG. Pomoću tehnologije genetskog inženjeringa, antitijela se mogu genetski modificirati kako bi se formirala bispecifična antitijela. Konstruirana su dva različita monoklonska antitijela, a Fab fragmenti ili varijabilni regioni teškog i lakog lanca dva antitijela su odvojeno cijepani. Reakcijom umrežavanja ili tehnologijom rekombinacije lanca, dva fragmenta su kombinovana kako bi se formiralo bispecifično antitijelo. Iako je složenost tehnologije genetskog inženjeringa relativno visoka, trenutno je to najčešće korištena metoda za proizvodnju bispecifičnih antitijela za podešavanje strukture i funkcije antitijela. Prilikom provođenja dizajna bispecifičnih antitijela, može se koristiti princip unakrsne reaktivnosti antitijela, ali unakrsna reaktivnost antitijela može uzrokovati nespecifične reakcije, tako da će se to pažljivo razmotriti u praktičnoj primjeni dizajna bispecifičnih antitijela, kao što je terapija bispecifičnim antitijelima.

Pročišćavanje bispecifičnih antitijela

Prečišćavanje bispecifičnih antitijela je proces izolacije i prečišćavanja ciljnih antitijela visoke čistoće. Dvije metode, centrifugiranje i duboka filtracija, koriste se za uklanjanje nekih rastvorljivih nečistoća. Ciljno bispecifično antitijelo se inicijalno hvata afinitetnom hromatografijom. Za bispecifična antitijela slična IgG koristi se afinitetna hromatografija proteina A, dok se za bispecifična antitijela koja nisu slična IgG može koristiti afinitetna hromatografija zasnovana na lakom lancu. Nakon toga, antitijelo se inkubira pod uslovima niskog pH tokom određenog vremenskog perioda, što uzrokuje poremećaj proteinske strukture na površini virusne ovojnice, čime se gubi sposobnost inficiranja ćelija. Međuduboka filtracija se vrši kako bi se dalje uklonile nečistoće poput proteina ćelije domaćina (HCP). Čistoća antitijela se poboljšava metodama kao što je jonoizmjenjivačka hromatografija, a svi preostali virusi se uklanjaju tehnikama nanofiltracije ili ultrafiltracije. Konačno, uzorak se koncentriše i zamjenjuje odgovarajućim puferom za formulaciju.

Tok rada usluge proizvodnje bispecifičnih antitijela

Koraci	Sadržaj usluge	Vremenska crta
Sinteza gena	Generisanje do 3 različite sheme dizajna sekvenci, de novo generisanje rekombinantnih DNK plazmida antitijela	2-3 sedmice
Test malog obima	Proizvodnja bispecifičnih proteinskih antitijela → Ekspresija u malom obimu u ćelijskim linijama sisara → Validacija SDS-PAGE metodom → Analiza vezivanja s rekombinantnim proteinskim antigenima ELISA metodom → Poređenje klonova s roditeljskim antitijelima	5-6 sedmica
Identificirati	Ekspresija prva dva bispecifična antitijela pune dužine → Analiza vezivanja ELISA metodom → ELISA evaluacija antitijela koje prepoznaju antimišja antitijela	1 sedmica
Proizvodnja antitijela	Proizvodnja antitijela velikih razmjera	3-4 sedmice

Naše prednosti

Pokrivamo uzvodne i nizvodne usluge proizvodnje antitijela i možemo pružiti tehničke usluge od pripreme antitijela, prečišćavanja bispecifičnih antitijela i odvajanja i prečišćavanja antitijela, sekvenciranja antitijela, validacije antitijela itd., koje se mogu koristiti za terapiju bispecifičnim antitijelima.

Visoka ekspresija

Visoka ekspresija proteina u CHO ćelijama.
Stabilno skladištenje

>2 sedmice u serumu na 37 °C.
Nema problema s topljivošću

>30 mg/ml
Stabilne ćelijske linije

Razvijene su mnoge stabilne ćelijske linije s tumorskim antigenima za validaciju mnogih bispecifičnih antitijela.