Technologie fágového displeje spočívá ve vložení cizího cílového genu do specifické pozice fágového kapsidového proteinu a expresi cizího genu na povrchu fága bez ovlivnění normální funkce fága. Po několika kolech screeningu byl konečně získán cílový protein se silnou specificitou a vysokou biologickou aktivitou.

Pomocí této technologie lze generovat vysokokapacitní knihovny protilátek. Screeningový cyklus je krátký, operační proces je přímočarý a rozsah aplikací je rozsáhlý, což umožňuje identifikaci optimálních sekvencí pro cílené peptidy nebo proteiny. V aplikacích souvisejících s viry mohou vědci screeningem velkých knihoven protilátek objevit protilátky, které se vážou na kritické virové epitopy. Tento proces může bránit vstupu, replikaci nebo mechanismům imunitního úniku virů, a tím položit základ pro léčbu onemocnění.

Technologie fágového displeje je využívána častěji než hybridomová technologie, která je omezena na produkci malého množství protilátek proti specifickým imunogenům. Naproti tomu technologie fágového displeje dokáže prezentovat celou knihovnu protilátek odvozených z různých imunitních druhů.

Technologie fágového displeje má širokou škálu aplikací, včetně screeningu receptorů patogenních mikroorganismů, studia proteinových interakcí, sledování přenosu signálů mezi buňkami, diagnostiky zvířecích onemocnění a vývoje vakcín, mimo jiné.

Technologie fágového displeje nabízí řadu výhod a lze ji aplikovat v různých oblastech. Hlavní výzvou při vývoji rekombinantních protilátek pomocí metody fágového displeje je však složitost a náklady spojené s tímto procesem. Tento přístup vyžaduje integraci technik molekulární biologie, včetně mutací, klonování a exprese, spolu s imunologickými, biochemickými a biofyzikálními analýzami pro identifikaci a charakterizaci požadovaných protilátek.

Prezentace antigenu je velmi důležitým článkem. Mezi metody prezentace antigenu patří zejména přímá prezentace potaženého antigenu, nepřímá prezentace potaženého antigenu, prezentace antigenu prostřednictvím screeningu celých buněk, prezentace antigenu pomocí liposomů, nanofosfolipidových disků a VLP.

Metoda přímého potahování je relativně jednoduchá, ale konformaci antigenu lze snadno změnit, zatímco nepřímé potahování je složité, ale dokáže zachovat konformaci antigenu a zlepšit účinnost prezentace. Buněčný screening může simulovat skutečnou situaci in vivo, ale existuje problém s nespecifickou vazbou. Nanofosfolipidový disk má malou velikost, vysokou účinnost podávání a dobrou stabilitu; VLP jsou fúzovány s antigenem nebo obaleny antigenem, což má vysokou imunogenicitu a dobrou bezpečnost a může vyvolat silnou imunitní odpověď.

Pokud je koncentrace příliš nízká, pravděpodobnost vazby s fágem se sníží, což má za následek sníženou účinnost screeningu. Naopak, nadměrně vysoká koncentrace může zvýšit pravděpodobnost nespecifické vazby, zesílit signál pozadí a bránit identifikaci pozitivních klonů.

Pro zamezení vysoké teploty, silných kyselin a zásad lze použít mírnou fixační metodu. Pro snížení poškození struktury antigenu byla použita metoda nepřímého potahování a systém biotin-streptavidin. Pokud je antigen membránový protein, může být vystaven na povrchu intaktních buněk nebo použit k simulaci membránového prostředí, například pomocí nanodisku, aby se zachovala jeho přirozená konformace membránového proteinu.

Kromě rutinních experimentů, jako je ELISA, Western blotting (WB) a imunofluorescence (IF), lze k monitorování vazebných a disociačních procesů protilátek a antigenů v reálném čase použít detekční techniky povrchové plazmonové rezonance (SPR) a biovrstvové interferometrie (BLI), což umožňuje stanovení afinity a kinetických parametrů.

Fágový displej lze využít k vytvoření monoklonálních protilátek s vysokou afinitou pro širokou škálu druhů produkujících protilátky, včetně, ale nikoli výhradně, lidí, myší, krys, králíků, kuřat, velbloudů, alpak, krav, psů, ovcí, opic a žraloků.

Technologie konstrukce knihoven myších protilátek je dobře zavedená, nákladově efektivní a má krátkou experimentální dobu, což ji činí vhodnou pro předběžný screening protilátek a základní výzkum. Králičí protilátky vykazují silnou afinitu a specificitu s širším rozsahem rozpoznávání epitopů ve srovnání s myšími protilátkami. Lidské protilátky lze získat přímo z knihoven lidských protilátek, čímž se zabrání potenciálním imunitním reakcím, které mohou nastat při podávání heterologních protilátek do lidského těla. Tento přístup má významnou hodnotu ve výzkumu a vývoji léčiv, zejména při vytváření terapeutických protilátek.

Zvířecí imunogeny se obecně dělí na proteinové antigeny, polypeptidové antigeny, antigeny nukleových kyselin a antigeny související s patogenem, mezi které antigeny související s patogenem zahrnují virový antigen (kompletní virová částice, virový protein, nestrukturální virový protein atd.), bakteriální antigen (kompletní bakteriální extrakt, složka buněčné stěny, sekretovaný protein, toxin atd.) a antigen parazita.

Upravte imunogeny nahrazením imunitních antigenů rekombinantními proteiny a nahrazením virových částic hasičského typu strukturními proteiny virů. Upravte experimentální design a modifikujte dávkování imunity.

Imunogenitu lze zvýšit vazbou antigenů s nosnými proteiny, jako je bovinní sérový albumin. Kromě toho lze k prodloužení doby zdržení in vivo a ke stimulaci aktivace a proliferace imunitních buněk, čímž se zlepší imunogenita, použít imunitní adjuvancia, včetně Freundova adjuvancia a hlinitého adjuvancia.

Knihovna fágových protilátek je soubor rozmanitých fágových protilátek vytvořených sestavením kompletní sady genů variabilní oblasti z protilátek do fágových vektorů a jejich expresí na povrchu fágů. Tento proces vede k vytvoření knihovny fágových protilátek.

Obecný proces fágového displeje zahrnuje několik klíčových kroků: extrakci periferních mononukleárních buněk z imunizovaných zvířat, izolaci celkové RNA a její transkripci do komplementární DNA (cDNA), amplifikaci cílového genu pomocí technologie polymerázové řetězové reakce (PCR), klonování cílového genu do fágového vektoru a transformaci vektoru do hostitelské buňky pro expresi. Tento proces vede ke konstrukci fágové knihovny, která dokáže rychle identifikovat protilátky s vysokou afinitou. Tato knihovna může následně sloužit jako cenný zdroj pro vývoj vakcín, terapeutických léčiv a diagnostických činidel.

Podle zdroje knihovny protilátek lze knihovny fágových protilátek rozdělit na knihovny imunitních fágových protilátek a knihovny nativních fágových protilátek. Hlavní rozdíl mezi těmito dvěma typy spočívá v tom, zda byla zvířata očkována. Nativní knihovny protilátek mohou být navíc generovány polosyntézou nebo syntézou.

Existují dva primární ukazatele pro hodnocení kvality knihovny protilátek: úložná kapacita a diverzita. Velká úložná kapacita v kombinaci s vysokou diverzitou zajišťuje efektivní screening protilátek s vysokou afinitou i specificitou.

V procesu biologické elutriace se zobrazovací knihovna inkubuje s fixními cíli a poté se důkladně promyje, aby se odstranily nereaktivní fágy. Konjugáty se obvykle eluují kyselým nebo vysoce soleným roztokem a následně se amplifikují ve vhodných hostitelských buňkách pro obohacení. Po 3 až 5 kolech screeningu se získají protilátky s vysokou afinitou.

Metody fágového screeningu zahrnují především panning na pevné fázi, screening v kapalné fázi a screening na bázi buněk. Výběr vhodné screeningové metody by měl zohlednit vlastnosti cílových molekul, cíle screeningového procesu a laboratorní prostředí.

Pozitivní screening je nejzákladnější metodou pro screening fágových protilátek, které se vážou na cílové proteiny. Negativní screening slouží k eliminaci nespecifických protilátek. Během procesu screeningu fágových protilátek mohou být nespecifické protilátky identifikovány v důsledku interference s cílovým antigenním značením, materiály nebo jinými antigeny se strukturální podobností s cílovým antigenem. V takových případech může negativní screening zvýšit účinnost screeningového procesu.

Metody pro ověřování protilátek obvykle zahrnují ELISA, Western blotting (WB), průtokovou cytometrii, imunoprecipitaci (IP), imunofluorescenci (IF), imunohistochemii a různé další experimentální techniky. Alpha Lifetech má rozsáhlé zkušenosti s detekcí protilátek a má profesionální experimentální tým, který zajišťuje účinnost protilátek v následných experimentech.