Co je protilátkové inženýrství?

S pomocí protilátkového inženýrství bylo možné modifikovat molekulární velikost, farmakokinetiku, imunogenicitu, vazebnou afinitu, specificitu a efektorovou funkci protilátek. Po syntéze protilátek je specifická vazba činí vysoce cennými v klinické diagnostice a léčbě. Díky protilátkovému inženýrství mohou splňovat potřeby raného vývoje léčiv a diagnostických metod.

Účelem protilátkového inženýrství je navrhnout a vyrobit vysoce specifické, stabilní funkce, kterých přirozené protilátky nemohou dosáhnout, a položit tak základ pro produkci terapeutických protilátek.

Společnost Alpha Lifetech, díky svým rozsáhlým zkušenostem s projekty v oblasti protilátkového inženýrství, může poskytovat služby v oblasti monoklonálních a polyklonálních protilátek na míru pro více druhů, stejně jako služby v oblasti konstrukce a screeningu knihoven protilátek pro fágový displej. Alpha Lifetech může zákazníkům poskytnout kvalitní biosimilární protilátky a rekombinantní proteinové produkty, jakož i odpovídající služby, pro produkci účinných, vysoce specifických a stabilních protilátek. Využíváním komplexních platforem protilátek, proteinů a systémů fágového displeje poskytujeme služby pokrývající předcházející i následné fáze produkce protilátek, včetně technických služeb, jako je humanizace protilátek, purifikace protilátek, sekvenování protilátek a validace protilátek.

Průkopnická fáze inženýrství protilátek souvisí se dvěma technologiemi:

--Technologie rekombinantní DNA

--Hybridomová technologie

Rychlý rozvoj protilátkového inženýrství souvisí se třemi důležitými technologiemi:

--Technologie klonování genů a polymerázová řetězová reakce

--Exprese proteinů: Rekombinantní proteiny jsou produkovány expresními systémy, jako jsou kvasinky, tyčinkovité viry a rostliny

--Počítačem podporovaný konstrukční návrh

První generace protilátek byla humanizována pro produkci chimérických protilátek, kde variabilní oblast myších monoklonálních protilátek byla navázána na konstantní oblast molekul lidského IgG. Vazebná oblast antigenu (CDR) myší monoklonální protilátky druhé generace byla transplantována do lidského IgG. S výjimkou oblasti CDR jsou všechny ostatní protilátky téměř lidské protilátky a bylo vynaloženo úsilí, aby se zabránilo indukci lidských antimyších protilátek (HAMA) při použití myších klonovaných protilátek pro léčbu lidí.

 

Pro konstrukci fágové knihovny je prvním krokem získání genů kódujících protilátky, které lze izolovat z B buněk imunizovaných zvířat (konstrukce imunitní knihovny), extrahovat přímo z neimunizovaných zvířat (konstrukce přirozené knihovny) nebo dokonce sestavit in vitro s fragmenty genů protilátek (konstrukce syntetické knihovny). Poté jsou geny amplifikovány pomocí PCR, vloženy do plazmidů a exprimovány ve vhodných hostitelských systémech (exprese v kvasinkách (obvykle Pichia pastoris), prokaryotická exprese (obvykle E. coli), exprese v savčích buňkách, exprese v rostlinných buňkách a exprese v hmyzích buňkách infikovaných tyčinkovitými viry). Nejběžnější je expresní systém E. coli, který integruje specifickou kódující sekvenci protilátek do fága a kóduje jeden z proteinů fágové slupky (pIII nebo pVIII). Genová fúze , A a je zobrazena na povrchu bakteriofágů. Jádrem této technologie je konstrukce fágové knihovny, která má oproti přirozeným knihovnám výhodu v tom, že se může specificky vázat. Následně jsou protilátky s antigenní specificitou testovány biologickým selekčním procesem, cílové antigeny jsou fixovány, nenavázané fágy jsou opakovaně odplavovány a navázané fágy jsou odplavovány pro další obohacení. Po třech nebo více kolech opakování jsou izolovány protilátky s vysokou specificitou a vysokou afinitou.

Obr. 3: Konstrukce a screening knihovny protilátek

Technologie rekombinantní DNA může být použita k vytvoření fragmentů protilátek. Protilátky Fab mohou být zpočátku hydrolyzovány pouze žaludeční proteázou za vzniku fragmentů (Fab')2, které jsou poté štěpeny papainem za vzniku jednotlivých fragmentů Fab. Fragment Fv se skládá z VH a VL, které mají nízkou stabilitu kvůli absenci disulfidových vazeb. VH a VL jsou proto spojeny krátkým peptidem o délce 15–20 aminokyselin a tvoří protilátku s jedním řetězcem variabilního fragmentu (scFv) s molekulovou hmotností přibližně 25 kDa.

Studium struktury protilátek u velbloudů (Camel, Liama ​​a Alpaca) objasnilo, že protilátky mají pouze těžké řetězce a žádné lehké řetězce, proto se jim říká protilátky těžkého řetězce (hcAb). Variabilní doména protilátek těžkého řetězce se nazývá jednodoménové protilátky nebo nanobody nebo VHH, o velikosti 12-15 kDa. Jako monomery nemají disulfidové vazby a jsou velmi stabilní s velmi vysokou afinitou k antigenům.

Obr. 5: Protilátka těžkého řetězce a VHH/nanobody

Volná exprese využívá expresi přirozené nebo syntetické DNA k dosažení syntézy proteinů in vitro, typicky za použití expresního systému E. coli. Produkuje proteiny rychle a při produkci velkého množství rekombinantních proteinů in vivo se vyhýbá metabolické a cytotoxické zátěži buněk. Může také produkovat proteiny, které se obtížně syntetizují, například ty, které se obtížně modifikují po translaci, nebo syntetizovat membránové proteiny.