Služba analýzy charakterizace aptamerů

Společnost Alpha Lifetech poskytuje služby související s aptamery již mnoho let a v současné době může poskytnout komplexní schémata vývoje aptamerů, jako je syntéza aptamerů, SELEX screening, vysoce výkonné sekvenování a optimalizace a charakterizace aptamerů. Na základě výhod metody SELEX pro screening aptamerů společnost Alpha Lifetech rozšířila další metody pro screening aptamerů.

Úvod do analýzy charakterizace aptamerů

Ověření afinity

Optimalizovaná afinita aptameru byla ověřena relevantními technikami vazebného testu aptameru. Mezi příklady patří izotermická titrační kalorimetrie (ITC), průtoková cytometrie (FCM), povrchová plazmonová rezonance (SPR), mikrofluidika atd. Afinita aptameru se obvykle vyjadřuje disociační konstantou (KD), fyzikální veličinou používanou ke kvantifikaci stupně molekulární disociace v reverzibilní reakci. Čím menší je hodnota KD, tím stabilnější je komplex, tj. tím silnější je afinita; Naopak, čím větší je hodnota KD, tím nestabilnější je komplex a tím slabší je afinita. Tento krok je klíčem k identifikaci výkonu aptameru, zajišťuje afinitní zrání aptameru a jeho schopnost vázat se na cílovou molekulu s vysokou afinitou a selektivitou v praktických aplikacích.

Obr. 1 Proces afinitní maturace aptameru. Zdroj:Kinghorn AB, Fraser LA, 2017.

Ověření funkce

Kromě ověření afinity je třeba ověřit i funkci aptameru. To zahrnuje ověření stability, specificity a interakcí aptameru s jinými molekulami v konkrétním prostředí. Výsledky funkčního ověření přímo ovlivní hodnotu aptamerů ve vědeckém výzkumu a průmyslových aplikacích.

Specifické ověření

Kompetitivní experiment: Schopnost aptameru vázat se na specifický cíl se hodnotí v přítomnosti jiných podobných cílů. Pokud se aptamer dokáže specificky vázat na cílovou molekulu bez interference s jinými molekulami, naznačuje to jeho vysokou specificitu.

Experiment s křížovou reakcí: Aptamer se naváže na řadu příbuzných nebo nesouvisejících cílů, aby se zjistilo, zda se váže pouze na specifický cíl, a tím se ověřila jeho specificita.

Ověření stability

Experiment s degradací nukleáz: Aptamery byly vystaveny různým koncentracím nukleáz a byla pozorována jejich degradace. Porovnáním stupně degradace v různých časových bodech lze vyhodnotit schopnost aptameru degradovat antinukleázová činidla.

Experiment s teplotní a časovou stabilitou: Aptamer byl umístěn do různých teplotních a časových podmínek, aby se pozorovala jeho strukturní a funkční stabilita. To pomáhá určit optimální podmínky skladování a použití aptamerů.

Identifikace biologické aktivity

Vhodná metoda se obvykle volí podle specifického cíle aplikace aptameru nukleové kyseliny.

(1) Testování na molekulární úrovni: Použití technik molekulární biologie, jako je gelová elektroforéza, Western blot atd., k detekci komplexů vytvořených po spojení aptameru s cílovou molekulou nebo k detekci změn v úrovni exprese cílové molekuly způsobených aptamerem.

(2) Testování na úrovni buněk: Pomocí technologie buněčných kultur se aptamery inkubují s cílovými buňkami za účelem pozorování biologických změn, jako je buněčná morfologie, proliferace a apoptóza, a vyhodnocení biologické aktivity aptamerů.

(3) Testování na zvířecích modelech: Ve vhodných zvířecích modelech se aptamery nukleových kyselin podávají injekčně nebo podáváním léků a fyziologické ukazatele a patologické změny u zvířat se pozorují za účelem vyhodnocení biologické aktivity a bezpečnosti aptamerů in vivo.