Hvad er antistofmanipulation?

Ved hjælp af antistofteknologi har det været muligt at modificere antistoffers molekylære størrelse, farmakokinetik, immunogenicitet, bindingsaffinitet, specificitet og effektorfunktion. Efter syntetisering af antistoffer gør den specifikke binding af antistoffer dem yderst værdifulde i klinisk diagnose og behandling. Gennem antistofteknologi kan de opfylde behovene for tidlig lægemiddel- og diagnostisk udvikling.

Formålet med antistofteknologi er at designe og producere meget specifikke, stabile funktioner, som naturlige antistoffer ikke kan opnå, og dermed lægge grundlaget for produktion af terapeutiske antistoffer.

Alpha Lifetech, med sin omfattende projekterfaring inden for antistofteknik, kan tilbyde skræddersyede monoklonale og polyklonale antistoftjenester til flere arter, samt konstruktion og screening af fagdisplay-antistofbiblioteker. Alpha Lifetech kan tilbyde kunder biosimilære antistoffer og rekombinante proteinprodukter af høj kvalitet, samt tilsvarende tjenester, for at producere effektive, yderst specifikke og stabile antistoffer. Ved at anvende omfattende antistof-, proteinplatforme og fagdisplaysystemer leverer vi tjenester, der dækker opstrøms og nedstrøms antistofproduktion, herunder tekniske tjenester såsom antistofhumanisering, antistofoprensning, antistofsekventering og antistofvalidering.

Den banebrydende fase inden for antistofudvikling er relateret til to teknologier:

--Rekombinant DNA-teknologi

--Hybridoma-teknologi

Den hurtige udvikling af antistofteknologi er relateret til tre vigtige teknologier:

--Genkloningsteknologi og polymerasekædereaktion

--Proteinekspression: Rekombinante proteiner produceres af ekspressionssystemer såsom gær, stavformede vira og planter

--Computerstøttet strukturdesign

Den første generation af antistoffer blev humaniseret til produktion af kimære antistoffer, hvor den variable region af musemonoklonale antistoffer blev bundet til den konstante region af humane IgG-molekyler. Antigenbindingsregionen (CDR) af det anden generations musemonoklonale antistof blev transplanteret til humant IgG. Bortset fra CDR-regionen er alle andre antistoffer næsten humane antistoffer, og der blev gjort en indsats for at undgå at inducere humane anti-museantistof (HAMA)-responser, når musekloneantistoffer blev brugt til human behandling.

 

For at konstruere et fagdisplaybibliotek er det første trin at opnå de gener, der koder for antistoffer, som kan isoleres fra B-celler fra immuniserede dyr (immunbibliotekskonstruktion), ekstraheres direkte fra ikke-immuniserede dyr (naturlig bibliotekskonstruktion) eller endda samles in vitro med antistofgenfragmenter (syntetisk bibliotekskonstruktion). Derefter amplificeres generne ved PCR, indsættes i plasmider og udtrykkes i passende værtssystemer (gærekspression (normalt Pichia pastoris), prokaryotisk ekspression (normalt E. coli), pattedyrcelleekspression, plantecelleekspression og insektcelleekspression inficeret med stavformede vira). Det mest almindelige er E. coli-ekspressionssystemet, som integrerer en specifik kodende antistofsekvens på fagen og koder for et af fagskalproteinerne (pIII eller pVIII). Genfusionen af ​​og vises på overfladen af ​​bakteriofager. Kernen i denne teknologi er at konstruere et fagdisplaybibliotek, som har den fordel i forhold til naturlige biblioteker, at det kan have specifik binding. Efterfølgende screenes antistoffer med antigenspecificitet gennem en biologisk selektionsproces, målantigener fikseres, ubundne fager vaskes væk gentagne gange, og bundne fager vaskes væk for yderligere berigelse. Efter tre eller flere runder med gentagelse isoleres antistoffer med høj specificitet og høj affinitet.

Fig. 3: Konstruktion og screening af antistofbibliotek

Rekombinant DNA-teknologi kan bruges til at generere antistoffragmenter. Fab-antistoffer kan i starten kun hydrolyseres af gastrisk protease for at producere (Fab')2-fragmenter, som derefter fordøjes af papain for at generere individuelle Fab-fragmenter. Fv-fragmentet består af VH og VL, som har dårlig stabilitet på grund af fraværet af disulfidbindinger. Derfor er VH og VL bundet sammen gennem et kort peptid på 15-20 aminosyrer for at danne et enkeltkædet variabelt fragment (scFv)-antistof med en molekylvægt på cirka 25 kDa.

Undersøgelsen af ​​antistofstrukturen hos kamelfamilien (kamel, liama og alpaka) har belyst, at antistoffer kun har tunge kæder og ingen lette kæder, derfor kaldes de tungkædede antistoffer (hcAb). Det variable domæne af tungkædede antistoffer kaldes enkeltdomæneantistoffer eller nanobodies eller VHH, med en størrelse på 12-15 kDa. Som monomerer har de ingen disulfidbindinger og er meget stabile med en meget høj affinitet for antigener.

Fig. 5: Tungkæde-antistof og VHH/nanostof

Cellefri ekspression udnytter ekspressionen af ​​naturligt eller syntetisk DNA til at opnå in vitro-proteinsyntese, typisk ved hjælp af E. coli-ekspressionssystemet. Det producerer proteiner hurtigt og undgår den metaboliske og cytotoksiske belastning på cellerne, når der produceres store mængder rekombinante proteiner in vivo. Det kan også producere proteiner, der er vanskelige at syntetisere, såsom dem, der er vanskelige at modificere efter translation, eller syntetisere membranproteiner.