Affinitätsmessplattform

Auf Basis der Octet- und Biacore-T2000-Plattform bietet Alpha Lifetech zuverlässige Affinitätsbestimmungsdienste an. Wir bestimmen die Affinität verschiedenster Proben, darunter Antikörper, Zellen, Proteine und niedermolekulare Substanzen. Dabei kommen unterschiedliche Methoden zum Einsatz, beispielsweise Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und Bio-Layer-Interferenz (BLI).

Alpha Lifetech bietet eine professionelle und präzise Plattform zur Affinitätsbestimmung, die ELISA mit Affinitätsmessung kombiniert und Kunden weltweit professionelle, effiziente, schnelle und präzise Ergebnisse liefert. Wir bieten zwei Methoden zur Auswahl: die schnelle und die präzise Affinitätsbestimmung. Die schnelle Affinitätsbestimmung misst die Affinität bei einer einzelnen Konzentration, während die präzise Affinitätsbestimmung die Affinität bei verschiedenen Konzentrationen erfasst. Die Plattform eignet sich zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen niedermolekularen Verbindungen, Peptiden, Proteinen, Oligonukleotiden und Oligomeren sowie Lipiden, Bakteriophagen, Viren und Zellen. Sie bildet die Grundlage für Affinitätstests und -screenings von Arzneimitteln, die Antikörperentwicklung und unterstützt weiterführende Forschungsarbeiten.

Einführung in die Bindungsaffinität

Die Affinität ist wichtig für die Bewertung intermolekularer Wechselwirkungen, für Affinitätsassays und das Wirkstoffscreening. Intermolekulare Wechselwirkungen lassen sich durch die Gleichung L + R = LR beschreiben, wobei L für freie Liganden, R für ungebundene Rezeptoren und LR für gebundene Ligand-Rezeptor-Komplexe steht. Bindungsreaktionen definieren intermolekulare Wechselwirkungen, bei denen während der Reaktion ein dynamischer Austausch zwischen gebundenen und ungebundenen Zuständen stattfindet, bis ein Gleichgewicht erreicht ist. Dies kann durch die beiden Geschwindigkeitskonstanten K_n (Bindungsgeschwindigkeitskonstante) und K_off (Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante) der Reaktion beschrieben werden. Der K_d-Wert, der Kehrwert der Bindungskonstante (K_a), ist K_off/K_n und eine wichtige Konstante für die Reaktionsaffinität. Je stärker die Bindung zwischen zwei Molekülen ist, desto höher ist die Affinität. Umgekehrt gilt: Je kleiner der K_d-Wert, desto geringer die Affinität. Diese Gleichung lässt sich in einem halblogarithmischen Diagramm als S-förmige Kurve darstellen, wobei die Ligandenkonzentration auf der x-Achse (logarithmische Skala) und die fraktionelle Grenze auf der y-Achse abgetragen wird. Die gestrichelte Linie repräsentiert die Ligandenkonzentration bei einer Kd (1 nM) und einer Bindungsfraktion von 0,5.

Abb. 1: Sigmoide Bindungskurve von Liganden unterschiedlicher Konzentration an den Zelloberflächenrezeptor. (Referenzquelle: Hunter SA, Cochran JR. Zellbindungsassays zur Bestimmung der Affinität von Protein-Protein-Interaktionen: Technologien und Überlegungen.)

Methoden zur Bestimmung der Affinität

ELISA-Bindungsaffinitätstest

Die weit verbreitete Methode zur Untersuchung der Antikörperaffinität basiert auf dem ELISA-Verfahren, das sich durch seine einfache Handhabung, Schnelligkeit, hohe Sensitivität und starke Spezifität auszeichnet. Es benötigt nur geringe Mengen an Reagenzien (Antikörper und Antigene) und ermöglicht die Messung der Antikörperaffinität ohne Aufreinigungsreagenzien. Dabei wird das Antigen auf einer festen Oberfläche immobilisiert und mit einem primären Antikörper detektiert. Der markierte sekundäre Antikörper reagiert mit dem primären Antikörper, und die Daten werden in einem ELISA-Reader (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ausgelesen und analysiert.

Abb. 2: ELISA-ähnliche Assays zur Bewertung der Bindung der designten Peptide an ihre Zielstrukturen. (Referenzquelle: Hajikarimlou, Maryam, et al., 2022. Ein computergestützter Ansatz zur schnellen Entwicklung von Peptiden, die das SARS-CoV-2-Oberflächenprotein S erkennen.)

Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Bindungsaffinitätstest

Die SPR-Technologie detektiert hauptsächlich Änderungen des Brechungsindex. Mithilfe traditioneller optischer Phänomene und der Lichtresonanz lässt sich eine Biosensorik-Technologie zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Biomolekülen entwickeln, um die Interaktion zwischen Liganden und Analyten auf Biosensorchips zu erfassen. Spezifische Signale für die Bindung und Interaktion von Biomolekülen können durch die Überwachung der dynamischen Änderungen der SPR-Winkel während biologischer Reaktionen gewonnen werden.

Abb. 3: Oberflächenplasmonenresonanz-(SPR)-Analyse der H10/AGR2-Bindung. (Referenzquelle: Garri, Carolina, et al., 2018. Identifizierung, Charakterisierung und Anwendung eines neuen Peptids gegen das anteriore Gradientenhomolog 2 (AGR2).)

Bio Layer Interference (BLI) Bindungsaffinitätstest

Die Biofilm-Interferenztechnologie ist eine markierungsfreie, optische Echtzeit-Detektionstechnik, die hauptsächlich zur umfassenden quantitativen Analyse intermolekularer Wechselwirkungen und zur Bestimmung der Proteinkonzentration eingesetzt wird. Diese Technologie nutzt einen sondenbasierten Biosensor, um Änderungen der Biofilmdicke auf der Probe direkt zu erfassen. Durch die Detektion der Verschiebungen im Interferenzspektrum werden die Bindung und Dissoziation von Biomolekülen auf der Sensoroberfläche erfasst und die Verschiebung (in nm) des Interferenzspektrums in Echtzeit angezeigt.

Abb. 4: Biolayer-Interferometrie (BLI)-Assay zwischen aLDRG und Chitinoligosacchariden. (Referenzquelle: Li, Bing, 2023. Kennzeichen des vergleichenden Transkriptoms zwischen Rhizomorphen und Hyphen von Armillaria sp. 541, die an der Pilzsymbiose teilnehmen, mit Schwerpunkt auf LysM-Domänen.)

Vergleich der BLI- und SPR-Technologie

Technologiename	BLI (Bio-Layer-Interferometrie)	SPR (Oberflächenplasmonenresonanz)
Prinzip	Das Gerät misst Veränderungen im Interferenzmuster des reflektierten Lichts auf der Sensoroberfläche und detektiert molekulare Wechselwirkungen über Änderungen der optischen Dicke der Bioschicht. Es liefert eine Bindungskurve in Echtzeit (direkte Messung).	Das System misst molekulare Wechselwirkungen durch die Erfassung von Signaländerungen des Brechungsindex nahe der Oberfläche des Sensorchips (diese treten auf, wenn Licht mit der Grenzfläche zwischen Gold und Glas interagiert und dadurch den Brechungsindex ändert). Die Daten werden als Änderungen des Resonanzwinkels dargestellt (indirekte Messung).
Hersteller	Sartorius	GE
Instrument	ForteBio Biosensoren	Offenes SPR-Instrument
System	ForteBio Octet-System (zur Analyse molekularer Wechselwirkungen)	TraceDrawer (entwickelt von Ridgeview Instruments, Schweden)
Vorteile	1. Breites Spektrum an Probenkompatibilität, ausgezeichnete Stabilität, insbesondere für den Nachweis kleiner Moleküle (die Anforderungen an Probenreinheit und Pufferbedingungen sind weniger streng). SSA-Chips sind kostengünstig für Bindungsstudien. 2. Schnellerer Durchsatz und kürzere Versuchszeiten im Vergleich zu SPR.	1. Längere Entwicklungsgeschichte, die im Vergleich zu BLI eine höhere Sensitivität bietet. 2. Höhere Präzision und Robustheit für spezifische Anwendungen, wie z. B. die Erkennung seltener oder wertvoller Proteine mit höherer Affinität und Spezifität.
Nachteile	1. Die Datengenauigkeit ist im Vergleich zu SPR etwas geringer. 2. Erfordert eine sorgfältige Wartung des Instruments. 3. Die Kosten für SSA-Chips sind relativ hoch.	1. Die Pufferbedingungen für den Nachweis sehr kleiner Moleküle können anspruchsvoll sein, was das Risiko eines Nachweisfehlers erhöht. 2. Chips sind im Allgemeinen teurer als die in BLI verwendeten. 3. Die Verdunstung der Probe während längerer Experimente kann ein Problem darstellen.
Chip-Typ	SSA-Chip	NTA-Chip

Umfang der Affinitätsmessung

Die Affinitätsbestimmung kann Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen (starke und schwache Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen), Protein-Protein-Wechselwirkungen, Protein-Peptid-Wechselwirkungen, Protein-Kleinmolekül-Wechselwirkungen und Protein-DNA/RNA-Wechselwirkungen (Aptamere) umfassen. Zur Bestimmung der Dissoziationskonstante (KD) ist die Kenntnis einer der molaren Konzentrationen erforderlich. Bei der Bindung von Kleinmolekülen darf das Molekulargewicht nicht unter 150 Dalton liegen.

Typ	Umfang	Vorsichtsmaßnahmen
1. Antigen-Antikörper-Beziehung	10^-6 bis 10^-12	Die Kd-Werte der meisten Antikörper liegen im Bereich von 10⁻⁶ bis 10⁻⁷ bzw. 10⁻⁹. Man geht allgemein davon aus, dass hochaffine Antikörper Werte unter 10⁻⁹ aufweisen, während hochaffine Antikörper Werte unter 10⁻¹² erreichen.
2. Proteine – Kleine Moleküle	10^-4 bis 10^-5	Die KD kleiner Moleküle und Proteine liegt zwischen 10^-4 und 10^-5, während 10^-3 und 10^-7 normal sind und 10^-10 nicht erreichen können. Kovalente kleine Moleküle können Werte von 10^-10 erreichen.
3. Avidin-Biotin	10^-14	Affinitätsproteine können leicht unspezifische Bindungen eingehen, daher kann Streptavidin oder entglykosyliertes Affinitätsprotein verwendet werden.
4. DNA-Protein	10^-8 bis 10^-10	Hochwertige und vollständige DNA; achten Sie darauf, den Einfluss der Elektrophorese zu vermeiden.

Probenanforderungen für die Affinitätsbestimmung

Probe	Anforderungen
1. Probe eines großen Moleküls	Protein > 50 µg, Antikörper > 100 µg, biotinyliertes Protein > 200 µg; Protein ohne Biotin > 2 mg, Reinheitsanforderung > 90 %, Pufferlösung: PBS, HEPBS. Darf keine Imidazolgruppen enthalten; Qualitätskontrolle erforderlich.
2. Probe eines kleinen Moleküls	Menge > 1 mg, Pulver oder Flüssigkeit. Die Flüssigkeit muss in Wasser oder DMSO löslich sein. Vermeiden Sie nach Möglichkeit Glycerin, Imidazol, Trehalose oder andere Salze. Verzichten Sie auf Reagenzien mit Aminogruppen wie Tris im Puffer (üblicherweise PBS, HEPPS usw. ohne organische Reagenzien).

Vorteile der Affinitätsmessungsplattform

Analyse mehrerer Proben

Alpha Lifetech bietet Affinitätsanalysen für verschiedene Proben an, darunter Antikörper, Zellen, Proteine und andere Biomoleküle.

Ausgereifte Technologieplattform

Wir verfügen über fortschrittliche Technologien wie den SPR-Bindungstest, den BLI-Bindungstest und den ELISA-Bindungstest.

Flexible Projektauswahl

Kunden können zwischen einer schnellen und einer präzisen Affinitätsbestimmung wählen.

Hochpräzise Ergebnisse

Unser professionelles technisches Team gewährleistet effiziente, genaue und zuverlässige Ergebnisse bei der Bestimmung der Verwandtschaft.

FallstudieFALL

BLI-Schnellaffinitätstest, Antikörper- und Aptameraffinitätstest

Biotinylierte Aptamere werden mit SA-Sondenspezifität gefangen und gelöst. Die Probe wird gelöst und auf eine definierte Konzentration verdünnt. Die sondenspezifisch gebundenen Ziel-1-5-Aptamere werden verfestigt und nach Signalsättigung an die Probe gebunden. Anschließend werden sie in eine 96-Well-Platte pipettiert.

Abb. 5: Verteilung der Detektionspositionen für Proben aus 96-Well-Platten. B bezeichnet den Puffer, der zum Ausgleich und zur Dissoziation der Sensoren verwendet wird. L: Biotin-Target-1-5-Aptamere, 221: Probe.

Achten Sie beim Bohren darauf, die Stabilität und Genauigkeit der Daten zu gewährleisten, und stellen Sie das entsprechende Programm ein, um die Ergebnisse zu erhalten:

Abb. 6: Interaktionsdiagramm zur Anpassung zwischen den Ziel-Aptameren 1, 2 und 3 und den Proben. (CH 1 \ 3 \ 5 repräsentiert das Signal und die Daten der Interaktion zwischen der verfestigten Ziel-1 \ 2 \ 3-Aptamersonde und der Probe.)

Abb. 7: Interaktionsdiagramm zwischen den Ziel-4- und Ziel-5-Aptameren und den Proben. (CH 1 \ 3 stellt das Signal und die Daten der Interaktion zwischen der verfestigten Ziel-4 \ 5-Aptamersonde und der Probe dar.)

Die Ergebnisse zeigen

Folgende Ergebnisse wurden erzielt: Die Affinität des Target-1-Adapters zur Probe nach der Anpassung betrug 9,41 ^ -8; die Affinität des Target-2-Adapters zur Probe nach der Anpassung beträgt 8,32 ^ -8; die Affinität des Target-3-Adapters zur Probe nach der Anpassung beträgt 8,64 ^ -8; die Affinität des Target-4-Adapters zur Probe nach der Anpassung beträgt 3,70 ^ -8; die Affinität des Target-5-Adapters zur Probe nach der Anpassung beträgt 3,01 ^ -8.

Bei Fragen können Sie sich jederzeit gerne an uns wenden.

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