Plattform für Tierimpfungen

Die Tierquellen von Alpha Lifetech sind transparent und verfügen über Inspektions- und Quarantänegenehmigungen, klar definierte genetische Hintergründe, genaue Impffrequenzen und detaillierte Aufzeichnungen der Impfintervalle. Dies ermöglicht komfortable Dienstleistungen für die Antikörperproduktion. Wir immunisieren hauptsächlich Kameliden (Alpaka, Liama und Kamele) und legen damit den Grundstein für die Nanokörperproduktion. Darüber hinaus können wir auch andere Tiere (wie z. B. Neuseeländer-Kaninchen, Mäuse usw.) gemäß den Anforderungen unserer Kunden hinsichtlich Impffrequenz und Immunogenität immunisieren, daraus PBMCs extrahieren und isolieren und diese für nachfolgende Experimente (z. B. die Entwicklung monoklonaler und polyklonaler Antikörper) verwenden. Kunden können ihre eigenen Immunogene bereitstellen, die wir einer strengen Qualitätskontrolle unterziehen. Falls Kunden virale Immunogene bereitstellen, müssen diese inaktiviert werden. Wir führen Inaktivierungstests durch, um die Sicherheit zu gewährleisten. Gleichzeitig können wir entsprechende Immunogene nach Kundenwunsch anpassen.

Einführung in die Tierimpfung

Bei der Herstellung tierischer Antikörper wie monoklonaler und polyklonaler Antikörper sowie Nanobodies besteht der erste Schritt darin, die Tiere zu immunisieren und entsprechende B-Zellen, Antikörper oder PBMCs zu gewinnen. Dies dient der Vorbereitung der weiteren Antikörperproduktion, der Förderung der Grundlagenforschung, der Entwicklung klinischer Diagnostika und der Unterstützung der Entdeckung und Entwicklung neuer Medikamente. Kamele, Alpakas, Liamas und andere Kamelarten (Camelidae) können durch Immunblutentnahme und Extraktion von PBMCs Nanobody-Bibliotheken (Antikörper mit einer einzigen Domäne) erzeugen. Kaninchen und andere Tiere können immunisiert werden, und aus ihren Körpern können Antikörper extrahiert werden. Nach der Aufreinigung können diese zur Herstellung polyklonaler Antikörper verwendet werden. Mäuse, Ratten usw. können zur Herstellung monoklonaler Antikörper durch Fusion von immunisierten B-Zellen mit Myelomzellen eingesetzt werden. Vor der Immunisierung sollten die 3R-Prinzipien (Ersetzen, Reduzieren, Verfeinern) beachtet werden. Dadurch kann die Anzahl der verwendeten Tiere auf das notwendige Minimum reduziert, die Versuchsabläufe verbessert und das Leiden der Tiere minimiert werden. Ein ordnungsgemäßes Versuchsdesign, die Auswahl geeigneter Antikörper und strenge Validierungsverfahren müssen ebenfalls eingehalten werden.

Klassifizierung von Immunogenen – Nanokörperproduktion

Arten von Immunogenen	Beispiel	Immunogenpräparation	Anmerkungen
Protein-Immunogene	Enzyme, Proteine, bakterielle Toxine und andere Substanzen	Wählen Sie verschiedene Proteinexpressionssysteme: E. coli, Hefe, Insektenzellen, Säugetierzellen und zellfreie Systeme.	Beachten Sie Faktoren wie Temperatur, Zeit, pH-Wert und Einschlusskörper, die die Proteinexpression beeinflussen.
Nukleinsäure-Immunogene	DNA, RNA	DNA-Immunogen: Plasmid-DNA konstruieren, geeignete Expressionsvektoren für Zielgene klonen, Zellen zur Amplifikation der Plasmid-DNA kultivieren und hochreine Plasmid-DNA extrahieren. RNA-Immunogen: Es müssen eine Hutstruktur und ein PolyA-Schwanz hinzugefügt werden, um den Abbau zu verhindern.	Bei der Herstellung von DNA-Immunogenen ist auf die Verwendung geeigneter Wirtszellen zu achten, und bei der Herstellung von RNA-Immunogenen ist darauf zu achten, dass der Abbau der RNA verhindert wird.
Virale Immunogene	Ganzvirus-inaktivierter Impfstoff, Subunit-Impfstoff, viraler Vektorimpfstoff (Adenovirus, Lentivirus usw.), mRAN-Impfstoff.	Bei der Herstellung eines Ganzvirusimpfstoffs wird das Virus zunächst inaktiviert, um die Sicherheit zu erhöhen. Toxizitätstests dienen der Überprüfung der vollständigen Inaktivierung. Subunit-Impfstoffe benötigen lediglich Virusoberflächenproteine als Antigene und müssen die Immunwirksamkeit berücksichtigen.	Zur Erzielung einer Immunwirkung müssen Adjuvantien hinzugefügt werden. Besonderes Augenmerk sollte auf das zu inaktivierende Virus gelegt werden. Geeignete Virustiter sind erforderlich, um eine Immunwirkung zu gewährleisten. Die Sicherheit des Herstellungsprozesses muss streng kontrolliert werden.

Ablauf oder Zeitplan der Tierimpfung

Tierauswahl und Antigenpräparation

Tierauswahl: Wählen Sie Alpakas des richtigen Alters und mit gesunder Konstitution aus gesunden Gruppen aus und führen Sie Blutuntersuchungen und Krankheitsscreenings durch, um sicherzustellen, dass keine Infektionskrankheiten oder andere Gesundheitsprobleme vorliegen.

Herstellung von Immunogenen: Immunogene sind der Schlüssel zur Auslösung von Immunreaktionen und erfordern die Auswahl geeigneter Proteine, Peptide oder anderer geeigneter Substanzen auf der Grundlage der Anforderungen des Zielantikörpers.

Ein Alpaka kann gleichzeitig mit 1–3 Antigenen immunisiert werden, wobei die Gesamtmenge des Antigens pro Immunisierung 1–2 mg und das Volumen weniger als 2 ml beträgt. Vor der Immunisierung werden Antigen und Adjuvans im Verhältnis 1:1 emulgiert, um eine homogene Mischung zu erhalten, die bei 4 °C gelagert wird.

Immunologisches Alpaka

Notieren Sie die Nummer des ungeimpften Alpakaohrs und beginnen Sie mit dem Immunisierungsexperiment. Injizieren Sie beidseitig in die Lymphknoten nahe dem Hals des Alpakas, jeweils zwei Injektionspunkte mit jeweils ca. 0,4 ml emulgiertem Antigen. Beobachten Sie das Alpaka nach der Immunisierung eine halbe Stunde lang, um sicherzustellen, dass es keine Anzeichen von Unwohlsein zeigt. Die Immunisierung sollte alle zwei Wochen wiederholt werden, mindestens jedoch viermal.

Blutentnahme

Nach vier Impfungen im Abstand von fünf bis sieben Tagen werden 50 ml Blut aus der Halsvene des Alpakas entnommen.

Serumtrennung

Vor jeder Antigenimmunisierung werden Blutproben für die Immunbewertung entnommen (jeweils 5 ml). Am selben Tag wird das Blut 30 Minuten lang bei 400 x g in einer vorgekühlten 25 °C-Zentrifuge zentrifugiert. Das Serum wird abgetrennt und für die spätere Antikörpertiterbestimmung aufbewahrt.

Lymphozyten trennen

Zuerst 15 ml Zellseparationslösung zugeben, dann langsam 15 ml Blut in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Beim Hinzufügen des Blutes vorsichtig und langsam vorgehen, um eine Vermischung von Blut und Separationslösung zu vermeiden. Die vorgekühlte Zentrifuge auf 25 °C vorkühlen und 30 Minuten bei 400 x g zentrifugieren. Das obere Serum in ein neues Zentrifugenröhrchen bei -80 °C überführen. Die mittlere, watteartige Schicht der Immunzellen mit einer Pipette in ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen absaugen. Zu jedem Röhrchen 10 ml PBS-Puffer (Raumtemperatur) geben und 20 Minuten bei 25 °C und 400 x g zentrifugieren. Den Überstand entfernen, zu jedem Röhrchen 5 ml PBS-Puffer (Raumtemperatur) geben, vorsichtig mischen, die Zellzahl mit einer Zählkammer bestimmen und erneut 20 Minuten bei 25 °C und 400 x g zentrifugieren. Den Überstand entfernen und die mit RNAiso Plus gewonnenen Lymphozyten entsprechend der Zellzahl auflösen, um 10^7/ml Zelllysat zu erhalten, das bei -80 °C gelagert wird.

Abb. 1: Schematische Darstellung verschiedener Strategien zur Antikörperentwicklung und der dazugehörigen experimentellen Schritte. (Quelle der Abbildung: Laustsen, Andreas H. et al.)

Kunden stellen Immunogene bereit – strenge Qualitätskontrolle

Arten von Immunogenen	Erfordernis	Qualitätskontrollmethode
Peptid- / Kleinmolekülproben	Auflösungsbedingungen (hauptsächlich abhängig davon, ob sie Phagen inaktivieren), Molekularstruktur/Peptidsequenz, Synthesebericht (HPLC/MS/HNMR)	HPLC/MS-Detektion
Proteinproben	SDS-PAGE/WB, Rekonstitutionsbedingungen, Puffer, Etiketteninformationen, Gesamtmenge (20–50 µg), Konzentration, Reinheit usw.	SDS-PAGE/WB
Zellproben	Zelltyp (Primärzellen/geneditierte Zellen), Zellform (frisch/aufgetaut), Wachstumstyp (adhärent/suspendiert), Anforderungen an das Kulturmedium, Anzahl der bereitgestellten Zellen, Anzahl der bereitgestellten Zellen, geneditierte Zellen zur Sicherstellung der stabilen Expression der Screening-Ziele (entsprechender primärer Antikörper des Kunden), aufgetaute Zellen zur Bestimmung der Ausbeute	Hauptsächlich werden geneditierte Zellen untersucht. Dabei werden vom Kunden bereitgestellte primäre Antikörper für die ELISA-Identifizierung der Zielexpression verwendet (unser Unternehmen stellt HRP-Sekundärantikörper bereit). Die Detektion erfolgt mittels Durchflusszytometrie (unser Unternehmen kann fluoreszierende Sekundärantikörper bereitstellen).

Welche Anwendungsgebiete hat die tierische Immunität?

+

Polyclonale Antikörper können durch Immunisierung von Tieren hergestellt werden, monoklonale Antikörper können durch Fusion von B-Zellen mit Myelomzellen hergestellt werden, und PBMCs können aus Kamelquellen (Alpaka, Kamel, Alpaka usw.) extrahiert werden, um verschiedene Antikörperfragmentformen wie Nanobodies, Fab-Fragmente, scFv-Antikörperfragmente usw. herzustellen.
Welche Vorkehrungen sind für die Immunität von Tieren zu treffen?

+

Zur Herstellung von Nanoantikörpern für Tiere kamelartiger Abstammung sind 5–6 Immunisierungen erforderlich. Vor der Immunisierung sollten Blutproben als Kontrolle entnommen werden, wobei zwischen den einzelnen Immunisierungen ein Abstand von 2 Wochen eingehalten wird. Nach der vierten Immunisierung werden positive und nicht immunisierte negative Blutproben für einen ELISA-Test zur Titerbestimmung entnommen. Liegt der Titer unter 10⁶, sollte die Anzahl der Immunisierungen erhöht werden, bis ein geeigneter Titer erreicht ist. Bei Immunisierungen anderer Tiere, wie z. B. Kaninchen (optimale oder übliche Proteinantigenkonzentration für die Kaninchenimmunisierung: 50–1000 µg), Mäuse (optimale oder übliche Proteinantigenkonzentration für die Mausimmunisierung: 5–50 µg, entsprechend 10⁶ Zellen bzw. 10–50 µg für Nukleinsäuren oder Kohlenhydrate), Ziegen (optimale oder übliche Proteinantigenkonzentration für die Ziegenimmunisierung: 250–5000 µg) usw., ist auf die Dosierung, Sicherheit und Wirksamkeit der Immunogene zu achten.
Wie wählt man immunen Tiere aus?

+

Je nach Art des vom Kunden benötigten Antikörpers können Sie für die Immunisierung Kamel- oder Alpaka-Derivate wählen, wenn Sie Nanobodies oder andere Antikörperfragmente herstellen möchten. Für die Produktion monoklonaler oder polyklonaler Antikörper wählen Sie die entsprechende Spezies anhand der Serummenge, des Antigens und der Antigenquelle. Kaninchen benötigen maximal 500 ml Serum, was eine geringe Antigenmenge erfordert und sie zur Herstellung polyklonaler Antikörper geeignet macht. Mäuse benötigen maximal 2 ml Serum, Ratten maximal 20 ml – diese Mengen sind in der Regel optimal für monoklonale Antikörper. Ziegenantikörper weisen eine hohe Affinität auf. Alpha Lifetech erstellt Ihnen gerne einen individuellen Immunisierungsplan, der auf Ihre Bedürfnisse zugeschnitten ist.
Müssen Antigene zusammen mit Adjuvantien verwendet werden? Wie wählt man sie aus?

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Es gibt zwei Arten von Adjuvantien: ölbasierte und wasserbasierte. Der sachgemäße Einsatz von Adjuvantien ist entscheidend für die Auslösung einer starken Antikörperantwort auf lösliche Antigene. Durch die verzögerte Freisetzung von Adjuvantien können weniger Antigen-Dosen verwendet werden, und die Antikörperantwort hält länger an. Die erste Injektion sollte in Kombination mit einem Adjuvans erfolgen. Im Allgemeinen wird die Verwendung von Freundschem Adjuvans empfohlen, wenn die Menge an Immunogen gering ist.
Vorsichtsmaßnahmen bei der Immunisierung von Alpakas?

+

(1) Die Auswahl von Alpakas und Immunisierungsantigenen ist entscheidend für eine erfolgreiche Immunisierung. Die Wahl eines wohlproportionierten Kamels ist nicht empfehlenswert. Reinheit und korrekte Konformation der Immunantigene sind unerlässlich für das Screening geeigneter Antikörper für nachfolgende Anwendungen nach der Immunisierung mit Alpakas. Die Reinheit von Proteinantigenen beträgt in der Regel mindestens 90 %.

(2) Trennung der Lymphozyten: Durch rechtzeitige Zelltrennung kann eine Hämolyse nach der Blutentnahme wirksam verhindert und so der beste Trenneffekt erzielt werden.

(3) Der Immunzyklus kann die Immunantwort beeinflussen: Ein 1-2 Wochen dauerndes Immunintervall ermöglicht es Alpakas, eine gute Immunantwort auf die meisten Antigene zu zeigen.

unabhängig entwickeltes Adjuvans

Unser einzigartiges Adjuvans wurde speziell für das Immunsystem von Alpakas optimiert und bietet eine höhere Wirksamkeit und Spezifität als herkömmliche Adjuvantien.

Impfstoffverabreichung
Standard

Wir garantieren die vollständige Immunisierung innerhalb der vorgegebenen Zeit, liefern Serum mit hohem Titer und dokumentieren jeden Schritt in detaillierten Berichten.

Projektqualitätskontrolle

Jedes Projekt durchläuft strenge Qualitätskontrollprozesse, um sicherzustellen, dass die Kunden Antikörper erhalten, die hohen Standards entsprechen.

deutlichAlpakaHintergrund

Wir verfügen über eine gesunde Alpaka-Population, die verschiedene Impfprogramme unterstützt.

Bei Fragen können Sie sich jederzeit gerne an uns wenden.

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