Antikörper-Affinitätsreifungsdienst

Alpha Lifetech Inc.Wir bieten die Affinitätsreifung von Antikörpern mittels Mutations- und Selektionstechnologien an. Üblicherweise verwenden wir scFv als Antikörperformat für die Affinitätsreifung und ein monovalentes Phagemid-Display-System, das zur Reduzierung von Aviditätseffekten beim Antigenbindungs-Screening eingesetzt wird. Unser Expertenteam bietet die Affinitätsreifung auch für Einzeldomänen-Antikörper an.

Alpha Lifetech Inc.ist stolz darauf, umfassende Dienstleistungen anzubieten, die den vielfältigen Bedürfnissen globaler Kunden gerecht werden. Unser Ziel ist es, die Anforderungen unserer unterschiedlichen Kunden zu verstehen und zu erfüllen sowie bei allen anstehenden und sich entwickelnden Problemen in der Forschungsarbeit zu unterstützen.

Was ist Affinitätsreifung?

Die Affinitätsreifung ist der Prozess, durch den Antikörper wiederholte Mutationen und Selektion durchlaufen, um ihre Affinität zu spezifischen Antigenen zu erhöhen. Hauptsächlich im Keimzentrum sekundärer lymphatischer Organe finden B-Zellen unter dem Einfluss von T-Zellen und follikulären dendritischen Zellen eine somatische Hypermutation und Selektion statt.
Während der Affinitätsreifung werden B-Zellen mit niedrigaffinen Oberflächen-Immunglobulinrezeptoren durch Antigenkontakt aktiviert und proliferieren und differenzieren. Durch somatische Hypermutation kommt es zu zufälligen Nukleotidsubstitutionen in der variablen Region der Immunglobulingene, was zur Produktion verschiedener Antikörpervarianten führt. Nach der somatischen Hypermutation erfolgt eine antigengetriebene Selektion der B-Zellen mit mutierten Immunglobulinrezeptoren. B-Zellen, die Antikörper mit erhöhter Antigenaffinität produzieren, werden bevorzugt zurückgehalten und können proliferieren, während B-Zellen mit verringerter oder unveränderter Affinität Apoptose erleiden. Dieser iterative Prozess aus Mutation und Selektion führt zur Entstehung von B-Zellklonen, die Antikörper mit sukzessive höherer Affinität zum Antigen produzieren.

Antikörper-Affinitätsreifungsdienst

Die Hauptvorteile PCR-basierter Methoden liegen darin, dass Mutationen präzise auf das amplifizierte Fragment ausgerichtet werden können; die Fehlerrate ist leicht zu kontrollieren; die Methode ist schnell und einfach durchzuführen und kommt ohne gefährliche Chemikalien aus. Es ist bekannt, dass die Taq-DNA-Polymerase DNA mit geringer Genauigkeit repliziert, hauptsächlich aufgrund des Fehlens einer 3'-5'-Korrekturlesefunktion.Alpha LifetechsDie Plattform für Antikörper-Engineering nutzt eine fehleranfällige PCR, um während der Subbibliothekskonstruktion hauptsächlich CDR-Regionen zu mutieren. Häufig werden Mutationen an völlig zufälligen Positionen innerhalb der gesamten VH- und VL-Fragmente erzeugt, um die genetische Diversität der Subbibliothek zu erhöhen. Nach der Konstruktion einer mutierten Antikörpergenbibliothek mittels fehleranfälliger PCR erfolgt die Selektion hochaffiner Varianten (die Affinität der scFv-Antikörper kann 10⁸ bis 10¹⁰ M erreichen) entweder durch Panning in Lösung oder an immobilisiertem Antigen unter für die Dissoziationsraten-abhängige Selektion optimierten Waschbedingungen.
  
Wissenschaftler inAlpha Lifetech Inc.Wir verwenden Escherichia coli-Mutatorstämme mutAD5™ als eine von mehreren Mutationsstrategien, um zufällige Mutationen einzuführen und dadurch die Affinität und Expression rekombinanter Antikörperfragmente zu modifizieren. Die Selektionsbedingungen können für Antikörperfragmente mit erhöhter Produktionsrate angepasst werden. Die Wachstumsbedingungen in Escherichia coli-Mutatorzellen können so eingestellt werden, dass pro Kilobase DNA eine einzelne zufällige Punktmutation eingeführt wird, was nahezu einer Codonänderung pro scFv-Fragment entspricht. Nach mehreren Zyklen aus Mutation, Expression und Selektion können wir die Affinitätskonstante von 10⁵–10⁶ M auf 10⁸–10¹⁰ M verbessern.

Strategien zur Affinitätsreifung verbessern

Bestimmte Positionen von Antikörpern können mit definierter Diversität randomisiert werden (z. B. vollständige Randomisierung mit allen 20 Aminosäuren oder gezielte Randomisierung mit ausgewählten Aminosäuren in festgelegten prozentualen Anteilen), um die Affinität zu verbessern. Wir verfolgen zwei Strategien zur Verbesserung der Antikörperaffinität: Erstens werden Mutationen an bestimmten Positionen in den komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) mittels ortsspezifischer Mutagenese eingeführt; zweitens werden Mutationen in die gesamten V-kodierenden Regionen mittels Zufallsmutagenese eingeführt. Durch die Anwendung dieser beiden Methoden werden die konservierten Aminosäuresequenzen oder die gesamte Gerüstregion des Antikörpers durch andere Aminosäuren ersetzt. In Kombination mit unseren Peptidbibliotheks-Scanning-Technologien kann dies die Affinität der gewünschten Antikörper extrem steigern.

Phagen-Display-Antikörper-Affinität

Sobald die scFv-Mutantenbibliothek erstellt ist, stehen zwei Screening-Strategien zur Verfügung: Biopanning und die Sortierung von Festantigenen. Beim Biopanning wird das Substrat schrittweise konzentriert, um die hochaffinen Antikörper zu isolieren, da die niedrigaffinen Mutanten ausgewaschen werden und die hochaviden Phagenpartikel zurückbleiben. Die zweite Strategie verwendet ein markiertes Antigen in Lösung, selektiert anhand der Gleichgewichtskonstante (Kd) und der Bindungskinetik. Dieser Selektionsansatz identifiziert Antikörpervarianten mit verbesserter Kd.

Bei Fragen können Sie sich jederzeit gerne an uns wenden.