Die Phagen-Display-Technologie besteht darin, das fremde Zielgen an einer spezifischen Stelle des Phagenkapsidproteins einzufügen und es so auf der Phagenoberfläche zu exprimieren, ohne die normale Funktion des Phagen zu beeinträchtigen. Nach mehreren Selektionsrunden wurde schließlich das Zielprotein mit hoher Spezifität und hoher biologischer Aktivität gewonnen.

Mit dieser Technologie lassen sich Antikörperbibliotheken mit hoher Kapazität erstellen. Der Screening-Zyklus ist kurz, die Durchführung unkompliziert und das Anwendungsspektrum breit gefächert, wodurch die Identifizierung optimaler Sequenzen für Zielpeptide oder -proteine ​​ermöglicht wird. In virusbezogenen Anwendungen können Forscher durch das Screening großer Antikörperbibliotheken Antikörper entdecken, die an kritische virale Epitope binden. Dieses Verfahren kann das Eindringen, die Replikation oder die Immunfluchtmechanismen von Viren hemmen und somit eine Grundlage für die Behandlung von Krankheiten schaffen.

Die Phagen-Display-Technologie ist weiter verbreitet als die Hybridom-Technologie, die auf die Produktion geringer Mengen von Antikörpern gegen spezifische Immunogene beschränkt ist. Im Gegensatz dazu kann die Phagen-Display-Technologie eine ganze Antikörperbibliothek präsentieren, die von verschiedenen Immunzellen stammt.

Die Phagen-Display-Technologie hat ein breites Anwendungsgebiet, darunter das Screening der Rezeptoren pathogener Mikroorganismen, die Untersuchung von Proteininteraktionen, die Verfolgung der Signalübertragung zwischen Zellen, die Diagnose von Tierkrankheiten und die Entwicklung von Impfstoffen, um nur einige Bereiche zu nennen.

Die Phagen-Display-Technologie bietet zahlreiche Vorteile und findet in verschiedenen Bereichen Anwendung. Die größte Herausforderung bei der Entwicklung rekombinanter Antikörper mittels Phagen-Display liegt jedoch in der Komplexität und den hohen Kosten des Verfahrens. Dieser Ansatz erfordert die Integration molekularbiologischer Techniken wie Mutation, Klonierung und Expression sowie immunologischer, biochemischer und biophysikalischer Analysen zur Identifizierung und Charakterisierung der gewünschten Antikörper.

Die Antigenpräsentation ist ein sehr wichtiges Bindeglied. Zu den Methoden der Antigenpräsentation gehören hauptsächlich die direkte Präsentation beschichteter Antigene, die indirekte Präsentation beschichteter Antigene, die Antigenpräsentation durch Ganzzell-Screening, die Antigenpräsentation mittels Liposomen, Nanophospholipid-Disks und VLPs.

Die direkte Beschichtungsmethode ist relativ einfach, jedoch kann sich die Antigenkonformation leicht verändern. Die indirekte Beschichtung ist zwar komplexer, erhält aber die Antigenkonformation und verbessert die Präsentationseffizienz. Zellscreenings simulieren reale In-vivo-Situationen, bergen jedoch das Problem unspezifischer Bindungen. Nanophospholipid-Discs zeichnen sich durch geringe Größe, hohe Freisetzungseffizienz und gute Stabilität aus. VLPs, die mit Antigen fusioniert oder umhüllt sind, weisen eine hohe Immunogenität und gute Sicherheit auf und können eine starke Immunantwort auslösen.

Ist die Konzentration zu niedrig, sinkt die Wahrscheinlichkeit einer Bindung an den Phagen, was die Screening-Effizienz verringert. Umgekehrt kann eine zu hohe Konzentration die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Bindungen erhöhen, das Hintergrundsignal verstärken und die Identifizierung positiver Klone erschweren.

Um hohe Temperaturen, starke Säuren und Laugen zu vermeiden, kann eine schonende Fixierungsmethode angewendet werden. Indirekte Beschichtungsverfahren und das Biotin-Streptavidin-System wurden eingesetzt, um die Schädigung der Antigenstruktur zu minimieren. Handelt es sich bei dem Antigen um ein Membranprotein, kann es auf der Oberfläche intakter Zellen präsentiert oder zur Simulation der Membranumgebung, beispielsweise auf Nanodisks, verwendet werden, um seine natürliche Membranproteinkonformation zu erhalten.

Neben Routineexperimenten wie ELISA, Western Blotting (WB) und Immunfluoreszenz (IF) können auch Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und Bio-Layer-Interferometrie (BLI) eingesetzt werden, um die Bindungs- und Dissoziationsprozesse von Antikörpern und Antigenen in Echtzeit zu überwachen und so die Affinität und kinetische Parameter zu bestimmen.

Mithilfe des Phagen-Displays können hochaffine monoklonale Antikörper für eine breite Palette von antikörperproduzierenden Spezies erzeugt werden, darunter unter anderem Menschen, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hühner, Kamele, Alpakas, Kühe, Hunde, Schafe, Affen und Haie.

Die Herstellung von Maus-Antikörperbibliotheken ist eine etablierte, kostengünstige und schnell zu realisierende Technologie, die sich daher für das vorläufige Antikörper-Screening und die Grundlagenforschung eignet. Kaninchen-Antikörper weisen eine hohe Affinität und Spezifität sowie ein breiteres Epitop-Erkennungsspektrum im Vergleich zu Maus-Antikörpern auf. Humane Antikörper können direkt aus humanen Antikörperbibliotheken gewonnen werden, wodurch potenzielle Immunreaktionen vermieden werden, die bei der Verabreichung heterologer Antikörper an den menschlichen Körper auftreten können. Dieser Ansatz ist von großem Wert für die Arzneimittelforschung und -entwicklung, insbesondere für die Entwicklung therapeutischer Antikörper.

Tierische Immunogene werden im Allgemeinen in Proteinantigene, Polypeptidantigene, Nukleinsäureantigene und pathogenassoziierte Antigene unterteilt. Zu den pathogenassoziierten Antigenen zählen Virusantigene (vollständige Viruspartikel, Virusproteine, nichtstrukturelle Virusproteine ​​usw.), Bakterienantigene (vollständiger Bakterienextrakt, Zellwandbestandteile, sezernierte Proteine, Toxine usw.) und Parasitenantigene.

Passen Sie die Immunogene an, indem Sie Immunantigene durch rekombinante Proteine ​​ersetzen und die Viruspartikel, die die Infektion bekämpfen, durch die Strukturproteine ​​der Viren ersetzen. Passen Sie das Versuchsdesign an und modifizieren Sie die Immundosis.

Die Immunogenität lässt sich durch die Kopplung von Antigenen an Trägerproteine ​​wie Rinderserumalbumin steigern. Zusätzlich können Immunadjuvantien, darunter Freundsches Adjuvans und Aluminiumadjuvans, eingesetzt werden, um die Verweildauer in vivo zu verlängern und die Aktivierung und Proliferation von Immunzellen zu stimulieren, wodurch die Immunogenität verbessert wird.

Eine Phagen-Antikörper-Bibliothek ist eine Sammlung verschiedener Phagen-Antikörper, die durch die Integration eines vollständigen Satzes variabler Regionengene von Antikörpern in Phagenvektoren und deren Expression auf der Oberfläche von Phagen entsteht. Dieser Prozess führt zur Bildung einer Phagen-Antikörper-Bibliothek.

Das Phagen-Display-Verfahren umfasst mehrere wichtige Schritte: die Extraktion peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) von immunisierten Tieren, die Isolierung der Gesamt-RNA und deren Transkription in komplementäre DNA (cDNA), die Amplifikation des Zielgens mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR), das Klonieren des Zielgens in einen Phagenvektor und die Transformation des Vektors in eine Wirtszelle zur Expression. Dadurch entsteht eine Phagen-Display-Bibliothek, mit der sich hochaffine Antikörper schnell identifizieren lassen. Diese Bibliothek dient anschließend als wertvolle Ressource für die Entwicklung von Impfstoffen, Therapeutika und Diagnostika.

Je nach Quelle der Antikörperbibliothek lassen sich Phagen-Antikörperbibliotheken in immunisierte und native Phagen-Antikörperbibliotheken unterteilen. Der Hauptunterschied zwischen diesen beiden Typen liegt darin, ob die Tiere geimpft wurden. Native Antikörperbibliotheken können zudem halbsynthetisch oder synthetisch hergestellt werden.

Es gibt zwei Hauptindikatoren zur Bewertung der Qualität einer Antikörperbibliothek: Speicherkapazität und Diversität. Eine hohe Speicherkapazität in Kombination mit hoher Diversität gewährleistet das effektive Screening von Antikörpern mit hoher Affinität und Spezifität.

Bei der biologischen Elutriation wird die Display-Bibliothek mit fixierten Zielmolekülen inkubiert und anschließend gründlich gewaschen, um nicht-reaktive Phagen zu entfernen. Die Konjugate werden typischerweise mit einer sauren oder hochkonzentrierten Salzlösung eluiert und anschließend in geeigneten Wirtszellen zur Anreicherung amplifiziert. Nach drei bis fünf Screening-Runden werden Antikörper mit hoher Affinität gewonnen.

Zu den wichtigsten Methoden für das Phagen-Screening zählen Festphasen-Panning, Flüssigphasen-Screening und zellbasiertes Screening. Bei der Auswahl einer geeigneten Screening-Methode sollten die Eigenschaften der Zielmoleküle, die Ziele des Screening-Prozesses und die Laborbedingungen berücksichtigt werden.

Das positive Screening ist die grundlegendste Methode zum Nachweis von Phagen-Antikörpern, die an Zielproteine ​​binden. Das negative Screening dient der Eliminierung unspezifischer Antikörper. Während des Phagen-Antikörper-Screenings können unspezifische Antikörper aufgrund von Interferenzen durch die Markierung des Zielantigens, durch Materialien oder durch andere Antigene mit struktureller Ähnlichkeit zum Zielantigen identifiziert werden. In solchen Fällen kann das negative Screening die Effizienz des Screening-Prozesses erhöhen.

Zu den gängigen Methoden zur Antikörperverifizierung gehören ELISA, Western Blot (WB), Durchflusszytometrie, Immunpräzipitation (IP), Immunfluoreszenz (IF), Immunhistochemie und verschiedene weitere experimentelle Techniken. Alpha Lifetech verfügt über umfassende Erfahrung im Antikörpernachweis und ein professionelles experimentelles Team, das die Wirksamkeit der Antikörper in nachfolgenden Experimenten sicherstellt.