Was ist Antikörper-Engineering?

Mithilfe von Antikörper-Engineering ist es möglich, die Molekülgröße, Pharmakokinetik, Immunogenität, Bindungsaffinität, Spezifität und Effektorfunktion von Antikörpern zu modifizieren. Nach der Synthese von Antikörpern ist deren spezifische Bindung für die klinische Diagnostik und Therapie äußerst wertvoll. Durch Antikörper-Engineering können sie den Anforderungen der frühen Arzneimittel- und Diagnostikentwicklung gerecht werden.

Ziel des Antikörper-Engineerings ist es, hochspezifische, stabile Funktionen zu entwickeln und herzustellen, die natürliche Antikörper nicht erreichen können, und damit die Grundlage für die Produktion therapeutischer Antikörper zu schaffen.

Alpha Lifetech bietet mit seiner umfassenden Projekterfahrung im Antikörper-Engineering maßgeschneiderte monoklonale und polyklonale Antikörper für verschiedene Spezies sowie die Erstellung und das Screening von Antikörperbibliotheken mittels Phagen-Display. Wir liefern unseren Kunden hochwertige Biosimilar-Antikörper und rekombinante Proteine ​​sowie die dazugehörigen Dienstleistungen zur Herstellung effizienter, hochspezifischer und stabiler Antikörper. Durch den Einsatz umfassender Antikörper-, Protein- und Phagen-Display-Plattformen decken wir die gesamte Wertschöpfungskette der Antikörperproduktion ab, einschließlich technischer Dienstleistungen wie Antikörper-Humanisierung, Antikörperreinigung, Antikörpersequenzierung und Antikörpervalidierung.

Die Pionierphase des Antikörper-Engineerings ist mit zwei Technologien verbunden:

--Rekombinante DNA-Technologie

Hybridom-Technologie

Die rasante Entwicklung des Antikörper-Engineerings hängt mit drei wichtigen Technologien zusammen:

--Genklonierungstechnologie und Polymerase-Kettenreaktion

--Proteinexpression: Rekombinante Proteine ​​werden durch Expressionssysteme wie Hefe, stäbchenförmige Viren und Pflanzen produziert.

--Computergestützte Tragwerksplanung

Die erste Generation von Antikörpern wurde für die Herstellung chimärer Antikörper humanisiert, indem die variable Region monoklonaler Mausantikörper mit der konstanten Region humaner IgG-Moleküle verknüpft wurde. Die Antigenbindungsregion (CDR) des monoklonalen Mausantikörpers der zweiten Generation wurde in humanes IgG übertragen. Mit Ausnahme der CDR-Region sind alle anderen Antikörper nahezu human, und es wurden Anstrengungen unternommen, um bei der Anwendung von Mausklonantikörpern zur Behandlung von Patienten die Induktion von humanen Anti-Maus-Antikörper-Reaktionen (HAMA) zu vermeiden.

 

Für die Erstellung einer Phagen-Display-Bibliothek werden zunächst die Gene gewonnen, die für Antikörper kodieren. Diese können aus B-Zellen immunisierter Tiere isoliert (Erstellung einer Immunbibliothek), direkt aus nicht immunisierten Tieren extrahiert (Erstellung einer natürlichen Bibliothek) oder in vitro mit Antikörpergenfragmenten assembliert werden (Erstellung einer synthetischen Bibliothek). Anschließend werden die Gene mittels PCR amplifiziert, in Plasmide kloniert und in geeigneten Wirtssystemen exprimiert (Hefeexpression, meist Pichia pastoris, prokaryotische Expression, meist E. coli, Expression in Säugetierzellen, Pflanzenzellen und mit stäbchenförmigen Viren infizierten Insektenzellen). Am häufigsten wird das E. coli-Expressionssystem verwendet. Dabei wird eine spezifische Antikörper-kodierende Sequenz in den Phagen integriert und eines der Phagenhüllproteine ​​(pIII oder pVIII) kodiert. Die Genfusion wird auf der Oberfläche der Bakteriophagen präsentiert. Kern dieser Technologie ist die Erstellung einer Phagen-Display-Bibliothek, die gegenüber natürlichen Bibliotheken den Vorteil einer spezifischen Bindung bietet. Anschließend werden Antikörper mit Antigen-Spezifität durch einen biologischen Selektionsprozess untersucht. Dabei werden Zielantigene fixiert, ungebundene Phagen wiederholt abgewaschen und gebundene Phagen zur weiteren Anreicherung abgewaschen. Nach drei oder mehr Wiederholungsrunden werden hochspezifische und hochaffine Antikörper isoliert.

Abb. 3: Konstruktion und Screening einer Antikörperbibliothek

Mithilfe der rekombinanten DNA-Technologie lassen sich Antikörperfragmente herstellen. Fab-Antikörper können zunächst nur durch Magensäureprotease hydrolysiert werden, wodurch (Fab')₂-Fragmente entstehen, die anschließend durch Papain in einzelne Fab-Fragmente gespalten werden. Das Fv-Fragment besteht aus VH und VL, die aufgrund fehlender Disulfidbrücken eine geringe Stabilität aufweisen. Daher werden VH und VL über ein kurzes Peptid von 15–20 Aminosäuren zu einem Einzelketten-Antikörperfragment (scFv) mit einer Molekülmasse von ca. 25 kDa verknüpft.

Die Untersuchung der Antikörperstruktur bei Kameliden (Kamel, Lama und Alpaka) hat gezeigt, dass Antikörper ausschließlich schwere Ketten und keine leichten Ketten besitzen. Daher werden sie als Schwerketten-Antikörper (hcAb) bezeichnet. Die variable Domäne der Schwerketten-Antikörper wird als Einzeldomänen-Antikörper, Nanobodies oder VHH bezeichnet und hat eine Größe von 12–15 kDa. Als Monomere weisen sie keine Disulfidbrücken auf, sind sehr stabil und besitzen eine sehr hohe Affinität zu Antigenen.

Abb. 5: Antikörper gegen schwere Kette und VHH/Nanokörper

Die zellfreie Expression nutzt die Expression natürlicher oder synthetischer DNA zur In-vitro-Proteinsynthese, typischerweise mithilfe des E. coli-Expressionssystems. Sie ermöglicht eine schnelle Proteinproduktion und vermeidet die metabolische und zytotoxische Belastung der Zellen, die bei der Herstellung großer Mengen rekombinanter Proteine ​​in vivo auftritt. Zudem können damit schwer zu synthetisierende Proteine ​​hergestellt werden, beispielsweise solche, die nach der Translation schwer zu modifizieren sind oder Membranproteine.