Was ist Antikörper-Engineering?

Mithilfe des Antikörper-Engineerings ist es gelungen, die Molekülgröße, Pharmakokinetik, Immunogenität, Bindungsaffinität, Spezifität und Effektorfunktion von Antikörpern zu verändern. Nach der Synthese von Antikörpern macht ihre spezifische Bindung sie für die klinische Diagnostik und Behandlung äußerst wertvoll. Durch Antikörper-Engineering können sie die Anforderungen der frühen Arzneimittel- und Diagnostikentwicklung erfüllen.

Der Zweck des Antikörper-Engineerings besteht darin, hochspezifische, stabile Funktionen zu entwickeln und herzustellen, die natürliche Antikörper nicht erreichen können, und so die Grundlage für die Produktion therapeutischer Antikörper zu legen.

Alpha Lifetech bietet dank seiner umfassenden Projekterfahrung im Antikörper-Engineering maßgeschneiderte monoklonale und polyklonale Antikörper für verschiedene Spezies sowie den Aufbau und das Screening von Phagendisplay-Antikörperbibliotheken an. Alpha Lifetech bietet seinen Kunden hochwertige biosimilare Antikörper und rekombinante Proteinprodukte sowie entsprechende Dienstleistungen zur Herstellung effizienter, hochspezifischer und stabiler Antikörper. Durch den Einsatz umfassender Antikörper-, Proteinplattformen und Phagendisplay-Systeme bieten wir Dienstleistungen für die vor- und nachgelagerte Phase der Antikörperproduktion an, darunter technische Dienstleistungen wie Antikörperhumanisierung, Antikörperreinigung, Antikörpersequenzierung und Antikörpervalidierung.

Die Pionierphase des Antikörper-Engineerings umfasst zwei Technologien:

--Rekombinante DNA-Technologie

--Hybridom-Technologie

Die rasante Entwicklung des Antikörper-Engineerings hängt mit drei wichtigen Technologien zusammen:

--Genklonierungstechnologie und Polymerase-Kettenreaktion

--Proteinexpression: Rekombinante Proteine ​​werden von Expressionssystemen wie Hefe, stäbchenförmigen Viren und Pflanzen produziert

--Computergestütztes Strukturdesign

Die erste Generation von Antikörpern wurde zur Herstellung chimärer Antikörper humanisiert, wobei die variable Region monoklonaler Maus-Antikörper mit der konstanten Region menschlicher IgG-Moleküle verknüpft wurde. Die Antigenbindungsregion (CDR) des monoklonalen Maus-Antikörpers der zweiten Generation wurde in menschliches IgG transplantiert. Mit Ausnahme der CDR-Region handelt es sich bei allen anderen Antikörpern um nahezu menschliche Antikörper. Daher wurde darauf geachtet, bei der Verwendung von Maus-Klon-Antikörpern zur Behandlung von Menschen die Auslösung menschlicher Anti-Maus-Antikörper (HAMA)-Reaktionen zu vermeiden.

 

Der Aufbau einer Phagendisplay-Bibliothek erfolgt zunächst durch die Gewinnung der Antikörper kodierenden Gene. Diese können aus B-Zellen immunisierter Tiere isoliert (Aufbau einer Immunbibliothek), direkt aus nicht immunisierten Tieren extrahiert (Aufbau einer natürlichen Bibliothek) oder sogar in vitro mit Antikörper-Genfragmenten zusammengesetzt werden (Aufbau einer synthetischen Bibliothek). Anschließend werden die Gene mittels PCR amplifiziert, in Plasmide inseriert und in geeigneten Wirtssystemen exprimiert (Hefe (meist Pichia pastoris), prokaryotische Expression (meist E. coli), Expression in Säugetierzellen, Pflanzenzellen und in mit stäbchenförmigen Viren infizierten Insektenzellen). Am gebräuchlichsten ist das E. coli-Expressionssystem, das eine spezifische kodierende Antikörpersequenz in den Phagen integriert und eines der Phagenschalenproteine ​​(pIII oder pVIII) kodiert. Die Genfusion wird durchgeführt und auf der Oberfläche von Bakteriophagen präsentiert. Kern dieser Technologie ist der Aufbau einer Phagendisplay-Bibliothek, die gegenüber natürlichen Bibliotheken den Vorteil der spezifischen Bindung bietet. Anschließend werden Antikörper mit Antigenspezifität durch einen biologischen Selektionsprozess gescreent, Zielantigene fixiert, ungebundene Phagen wiederholt ausgewaschen und gebundene Phagen zur weiteren Anreicherung ausgewaschen. Nach drei oder mehr Wiederholungsrunden werden hochspezifische und hochaffine Antikörper isoliert.

Abb. 3: Aufbau und Screening einer Antikörperbibliothek

Mithilfe der rekombinanten DNA-Technologie lassen sich Antikörperfragmente erzeugen. Fab-Antikörper können zunächst nur durch Magenprotease hydrolysiert werden, um (Fab')2-Fragmente zu bilden, die anschließend durch Papain verdaut werden, um einzelne Fab-Fragmente zu erzeugen. Das Fv-Fragment besteht aus VH und VL, die aufgrund fehlender Disulfidbrücken eine geringe Stabilität aufweisen. Daher werden VH und VL über ein kurzes Peptid von 15–20 Aminosäuren miteinander verbunden, um einen Einzelketten-Variablenfragment-Antikörper (scFv) mit einem Molekulargewicht von ca. 25 kDa zu bilden.

Die Untersuchung der Antikörperstruktur bei Kamelen (Kamel, Lama und Alpaka) hat ergeben, dass Antikörper nur schwere Ketten, aber keine leichten Ketten aufweisen. Daher werden sie als Schwerkettenantikörper (hcAb) bezeichnet. Die variable Domäne von Schwerkettenantikörpern wird als Einzeldomänenantikörper oder Nanobodies (VHH) bezeichnet und hat eine Größe von 12–15 kDa. Als Monomere besitzen sie keine Disulfidbrücken und sind sehr stabil sowie weisen eine sehr hohe Affinität zu Antigenen auf.

Abb. 5: Schwerketten-Antikörper und VHH/Nanobody

Die zellfreie Expression nutzt die Expression natürlicher oder synthetischer DNA zur In-vitro-Proteinsynthese, typischerweise unter Verwendung des E. coli-Expressionssystems. Sie produziert Proteine ​​schnell und vermeidet die metabolische und zytotoxische Belastung der Zellen bei der Produktion großer Mengen rekombinanter Proteine ​​in vivo. Sie ermöglicht auch die Produktion schwer synthetisierbarer Proteine, beispielsweise solcher, die nach der Translation schwer zu modifizieren sind, oder die Synthese von Membranproteinen.