Plattform zur Entwicklung der Antikörper-Humanisierung

Humanisierte Antikörper lösen beim menschlichen Immunsystem nur eine minimale oder gar keine Reaktion aus. Laut Cognitive Market Research wird der globale Markt für Antikörperhumanisierung im Jahr 2024 ein Volumen von 92,5 Millionen US-Dollar erreichen und von 2024 bis 2031 mit einer durchschnittlichen jährlichen Wachstumsrate (CAGR) von 13,00 % wachsen. Alpha Lifetech verfügt über eine ausgereifte Plattform zur Antikörperhumanisierung mit einer Erfolgsrate von über 98 %. Wir bieten verschiedene Humanisierungsstrategien an, darunter CDR-Grafting, SDR-Grafting, Ketten-Shuffling und Phagen-Display, die wir je nach Ihren experimentellen Anforderungen auswählen. Wir humanisieren nicht nur Antikörper verschiedener Spezies wie Mäuse, Kaninchen, Alpakas und Kamele, sondern auch Antikörper in unterschiedlichen Formen wie scFv, Fab und Nanobodies. Wir verfügen über professionelles Fachpersonal für die Herstellung, Aufreinigung und Validierung von Antikörpern, einschließlich der Produktion monoklonaler Mausantikörper, chimärer Antikörper, humanisierter Antikörper (Expression und Aufreinigung) sowie deren Charakterisierung und Analyse. Wir garantieren die Herstellung humanisierter Antikörper mit hoher Erfolgsrate, hoher Reinheit und geringer Immunogenität.

Einführung in die Antikörperhumanisierung

Die Therapie mit monoklonalen Antikörpern kann zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und anderen Krankheiten eingesetzt werden. Monoklonale Antikörper werden durch Immunisierung von Mäusen oder anderen Tieren hergestellt. Bei der Anwendung in späteren Phasen der monoklonalen Antikörperproduktion darf die Immunogenität nicht-humaner Antikörper nicht außer Acht gelassen werden. Das Hauptprinzip der Humanisierung besteht darin, nicht-humane Strukturelemente, wie z. B. hypervariable komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs), in die humane Struktur zu integrieren. Dadurch entstehen Sequenzen, die die ursprünglichen Antikörpereigenschaften beibehalten, aber gleichzeitig Immunogenität verhindern. Die Immunisierung von Mäusen und die anschließende Humanisierung der Maussequenzen sind nach wie vor zwei der wichtigsten Wege zur Entwicklung therapeutischer Antikörper. Diese Prozesse umfassen im Wesentlichen mehrere Schritte: die Herstellung von Mausantikörpern, die Chimärisierung monoklonaler Antikörper, die Herstellung chimärer Maus-Human-monoklonaler Antikörper und die Entwicklung vollständig humanisierter monoklonaler Antikörper. Aktuell umfasst die Forschung hauptsächlich transgene Mäuse (Übertragung menschlicher B-Zell-Gene in Mäuse), Hochdurchsatz-Screening mittels Hefe- oder Phagen-Display-Technologie, CDR-Grafting (Einfügen elterlicher CDRs in menschliche Sequenzen), transplantationsspezifische Bestimmungsreste (SDR), Framework-Shuffling und andere Methoden.

Antikörper-Humanisierung – Alpha Lifetech

Abb. 1: Schematische Übersicht der Antikörper-Humanisierung von murinen Antikörpern (grüne Domänen) zu vollständig humanen Antikörpern.

Strategie zur Humanisierung von Antikörpern

CDR-Pfropfung

Die CDR-Transplantation erfolgt mittels eines auf rekombinanter DNA-Technologie basierenden Expressionssystems in Säugetierzellen. Die wichtigsten Schritte sind:

(1) Entsprechende Antikörper in Mäusen (oder nicht-menschlichen Quellen) entwickeln, DNA, die für Antikörper kodiert, isolieren und diese in Vektoren zur Sequenzierung klonen (oder direkt eine Einzelzellsequenzierung durchführen).

(2) Die Bestimmung der DNA-Sequenz, die der CDR des Antikörpers entspricht, und die Bestimmung der Zielbindungsspezifität;

(3) Wählen Sie die humane Rahmenregion (FR) aus, um nicht-humane CDRs zu transplantieren und ein neues Antikörpergen zu konstruieren.

(4) Es ist eine dreidimensionale Analyse der Konflikte zwischen nicht-humanen CDRs und humanen FRs durchzuführen, um Wiederherstellungsmutationen zu generieren, die die Schleife stabilisieren und den Verlust der Affinität oder der strukturellen Integrität des endgültigen humanisierten Antikörpers verhindern.

Abb. 2: Schematische Übersicht der CDR-Pfropfung (Complementarity Determined Region).

Umstrukturierung der Rahmenbedingungen

Das Framework-Shuffling nutzt Phagen-Display-Technologie und Phagenbibliothek-Screening zur Gewinnung hochaffiner Antikörper. Oligonukleotide, die für die Gerüststrukturen der schweren Ketten humaner Antikörper kodieren, dienen als Matrizen. CDR-Regionen werden als Primer kodiert. Durch PCR-Amplifikation wird das PCR-Produkt denaturiert, um einzelsträngige DNA zu erhalten. Die mit Streptavidin gereinigte einzelsträngige DNA der VL- und VH-Gene wird mithilfe von T4-DNA-Ligase und Restriktionsenzymen in Vektoren kloniert, mit Bakteriophagen inkubiert und durch diese amplifiziert. Anschließend wird eine Phagen-Display-Bibliothek erstellt. Drei Screening-Runden mit den entsprechenden Antigenen werden durchgeführt, und positive Klone werden abschließend mittels ELISA und anderen Methoden verifiziert.

Abb. 3: Schematische Darstellung der Humanisierungsstrategien durch CDR-Grafting (Complementarity Determined Region) und FR-Shuffling (Framework). (A) Das Hauptverfahren des CDR-Graftings. (B) Der Hauptprozess des FR-Shufflings. (Referenzquelle: Wang Yongmei et al., Vergleich von „Framework Shuffling“ und „CDR Grafting“ bei der Humanisierung eines murinen PD-1-Antikörpers.)

Phagenanzeige

Die Herstellung humanisierter Antikörper basiert auf der Präsentation spezifischer Antikörper auf der Oberfläche von Bakteriophagen, die hauptsächlich mithilfe humaner Antikörper-Phagenbibliotheken erstellt werden. Die Bibliotheken werden aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) isoliert, aus denen die entsprechenden Sequenzen identifiziert werden. Diese Sequenzen enthalten die vollständige humane Sequenz, die produzierten Antikörper sind jedoch Antikörperfragmente wie scFv, Fab und Nanokörper.

Workflow des Antikörper-Humanisierungsdienstes

Serviceschritte	Qualitätskontrollstandard	Zeitleiste
Antikörperisolierung	Reinheit >95%	1-2 Wochen
Sequenzanalyse	Genaue Identifizierung nicht-menschlicher Sequenzen	1 Woche
CDR-Grafting und Framework-Grafting	Erfolgreiche Integration und Ausdruck	2-3 Wochen
Expression und Reinigung	Hohe Ausbeute und Reinheit	2-3 Wochen
Funktionale Validierung	Affinitäts- und Spezifitätsbewertung	1 Woche

Vorteile der Antikörper-Humanisierungsplattform

Alpha Lifetech verfügt über eine ausgereifte Plattform zur Humanisierung von Antikörpern mit einer Erfolgsquote von über 98 % bei humanisierten Antikörpern.