Aptamer-Charakterisierungsanalyse-Service

Alpha Lifetech bietet seit vielen Jahren Dienstleistungen im Bereich Aptamere an und kann derzeit umfassende Aptamerentwicklungskonzepte wie Aptamersynthese, SELEX-Screening, Hochdurchsatzsequenzierung sowie Aptameroptimierung und -charakterisierung anbieten. Aufbauend auf den Vorteilen der SELEX-Methode für das Aptamer-Screening hat Alpha Lifetech weitere Screening-Methoden für Aptamere entwickelt.

Einführung in die Aptamer-Charakterisierungsanalyse

Affinitätsprüfung

Die optimierte Aptamer-Affinität wurde mittels relevanter Techniken durch Aptamer-Bindungsassays verifiziert. Beispiele hierfür sind die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), die Durchflusszytometrie (FCM), die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und Mikrofluidik. Die Aptamer-Affinität wird üblicherweise durch die Dissoziationskonstante (K_D) ausgedrückt, eine physikalische Größe zur Quantifizierung des Dissoziationsgrades von Molekülen in einer reversiblen Reaktion. Je kleiner der K_D-Wert, desto stabiler der Komplex und desto stärker die Affinität; umgekehrt gilt: Je größer der K_D-Wert, desto instabiler der Komplex und desto schwächer die Affinität. Dieser Schritt ist entscheidend für die Beurteilung der Leistungsfähigkeit des Aptamers, da er die Reifung der Aptamer-Affinität sicherstellt und gewährleistet, dass es in praktischen Anwendungen mit hoher Affinität und Selektivität an das Zielmolekül binden kann.

Abb. 1 Prozess der Aptamer-Affinitätsreifung. Referenzquelle:Kinghorn AB, Fraser LA, 2017.

Funktionsprüfung

Neben der Affinitätsprüfung muss auch die Funktion des Aptamers verifiziert werden. Dies umfasst die Überprüfung seiner Stabilität, Spezifität und Wechselwirkungen mit anderen Molekülen in einer bestimmten Umgebung. Die Ergebnisse der Funktionsprüfung beeinflussen direkt den Nutzen von Aptameren in der wissenschaftlichen Forschung und in industriellen Anwendungen.

Spezifische Überprüfung

Wettbewerbsexperiment: Die Fähigkeit des Aptamers, an ein spezifisches Zielmolekül zu binden, wird in Gegenwart anderer ähnlicher Zielmoleküle untersucht. Bindet das Aptamer spezifisch an das Zielmolekül ohne Störungen durch andere Moleküle, deutet dies auf eine hohe Spezifität hin.

Kreuzreaktionsexperiment: Das Aptamer wird an eine Reihe verwandter oder nicht verwandter Zielstrukturen gebunden, um zu prüfen, ob es nur an eine bestimmte Zielstruktur bindet und somit seine Spezifität zu bestätigen.

Stabilitätsprüfung

Nuklease-Abbauversuch: Die Aptamere wurden verschiedenen Nukleasekonzentrationen ausgesetzt und ihr Abbau beobachtet. Durch Vergleich des Abbaugrades zu verschiedenen Zeitpunkten lässt sich die Fähigkeit des Aptamers, Nukleasen zu hemmen, bewerten.

Stabilitätsexperiment unter Temperatur- und Zeitbedingungen: Das Aptamer wurde verschiedenen Temperatur- und Zeitbedingungen ausgesetzt, um seine strukturelle und funktionelle Stabilität zu untersuchen. Dies trägt zur Bestimmung optimaler Lager- und Anwendungsbedingungen für Aptamere bei.

Identifizierung biologischer Aktivitäten

Die geeignete Methode wird üblicherweise nach dem spezifischen Anwendungsziel des Nukleinsäure-Aptamers ausgewählt.

(1) Testung auf molekularer Ebene: Mithilfe molekularbiologischer Techniken wie Gelelektrophorese, Western Blot usw. werden die Komplexe, die sich nach der Bindung des Aptamers an das Zielmolekül bilden, oder die durch das Aptamer verursachten Veränderungen im Expressionsniveau des Zielmoleküls nachgewiesen.

(2) Zellbasierte Testung: Mithilfe der Zellkulturtechnologie werden Aptamere mit Zielzellen inkubiert, um biologische Veränderungen wie Zellmorphologie, Proliferation und Apoptose zu beobachten und die biologische Aktivität der Aptamere zu bewerten.

(3) Tiermodellprüfung: In geeigneten Tiermodellen werden Nukleinsäure-Aptamere durch Injektion oder Medikamentengabe verabreicht. Anschließend werden physiologische Indikatoren und pathologische Veränderungen der Tiere beobachtet, um die biologische Aktivität und Sicherheit der Aptamere in vivo zu bewerten.