Aptamer-Forschungsdienst
Entsprechend den unterschiedlichen Analysebedürfnissen der Kunden bietet Alpha Lifetech eine Vielzahl von Aptameranalysestrategien zur Auswahl an.
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Aptamer-Forschungsdienst
Einführung in Aptamere
Aptamere sind einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle (wie DNA oder RNA), die in vitro aus einer Bibliothek synthetischer Oligonukleotide mit zufällig zugewiesenen Sequenzen mittels SELEX-Screening identifiziert werden. Dieses Verfahren umfasst mehrere iterative Selektionsrunden. Zu den Hauptkomponenten der Aptamerentwicklungsdienstleistungen von Alpha Lifetech gehören die Erstellung von Aptamerbibliotheken, das Aptamer-SELEX-Screening, die Aptamer-SELEX-Sequenzierung, die Aptamersequenzanalyse und weitere Aptameranalysen.
Die SELEX-Sequenzierung kombiniert Aptamer-SELEX-Screening mit Hochdurchsatzsequenzierung. Durch die Aptamer-SELEX-Sequenzierung lässt sich die spezifische Sequenz des an das Zielmolekül gebundenen Aptamers effizient bestimmen und liefert so grundlegende Daten für die nachfolgende Aptamersequenzanalyse und -anwendung.
Aptamere finden breite Anwendung in der wissenschaftlichen Forschung, der Krankheitsbehandlung, der Entwicklung von Biosensoren, der Medikamentenentwicklung und der Umweltüberwachung. Allerdings werden in vitro gescreente Oligonukleotid-Aptamere in vivo leicht abgebaut und können sogar toxisch wirken. Daher ist nach der Optimierung der gescreenten Aptamere eine In-vitro-Analyse erforderlich, um den Erfolg der Aptamerentwicklung zu bewerten. Alpha Lifetech bietet seinen Kunden verschiedene Aptameranalysestrategien an, um deren unterschiedlichen Analysebedürfnissen gerecht zu werden.
Abb. 1: Schema der Aptameranalyse. Referenzquelle:Thevendran R, Citartan M. 2022. Assays zur Abschätzung der Bindungsaffinität von AptamerenDie
Einführung in den Aptamer-Forschungsdienst
Aptamer-Stabilitätsanalyse
Nuklease-Abbauexperiment
Durch Inkubation des Aptamers mit verschiedenen Nukleasetypen (wie DNase, RNase usw.) unter spezifischen Bedingungen wird der Abbau des Aptamers beobachtet, um so seine Beständigkeit gegenüber dem Abbau zu bewerten. Dies ist hilfreich, um die Stabilität und Haltbarkeit des Aptamers in praktischen Anwendungen zu bestimmen.
Fluoreszenzmarkierungsmethode
Die Stabilität des Aptamers wird indirekt bestimmt, indem die Fluorophore des Aptamers markiert und die Veränderungen des Fluoreszenzsignals vor und nach der Bindung an das Zielmolekül beobachtet werden. Bindet ein Aptamer beispielsweise an ein Zielmolekül, kann sich seine Konformation ändern, was zu einem verstärkten oder abgeschwächten Fluoreszenzsignal führt.
Analyse der thermischen Stabilität
Die thermische Stabilität des Aptamers wird durch Messung der Änderung seiner Schmelztemperatur (Tm-Wert) bei verschiedenen Temperaturen bestimmt. Je höher die Schmelztemperatur des Aptamers ist, desto besser ist seine thermische Stabilität.
Dynamische Stabilitätsanalyse
Mithilfe der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und anderer Technologien wurde der Bindungs- und Entkopplungsprozess zwischen dem Aptamer und dem Zielmolekül in Echtzeit überwacht, dynamische Parameter (wie z. B. die Bindungsgeschwindigkeitskonstante, die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante usw.) ermittelt, der Interaktionsmechanismus zwischen dem Aptamer und dem Zielmolekül besser verstanden und dessen dynamische Stabilität bewertet.
Strukturelle Stabilitätsanalyse
Zur Analyse der dreidimensionalen Struktur des Aptamers und seiner strukturellen Stabilität wurden Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz (NMR) und andere strukturbiologische Techniken eingesetzt.
Aptamerspezifische Analyse
Aptamer-Bindungsassay
Die Affinität wird mittels Aptamer-Bindungsassay bestimmt, indem die Bindungskonstante zwischen Aptamer und Zielmolekül, beispielsweise die Dissoziationskonstante Kd, gemessen wird. Ein niedrigerer Kd-Wert deutet auf eine höhere Affinität hin. Mit Aptamer-Bindungsassays lassen sich Wirkstoffkandidaten mit hoher Bindungsfähigkeit identifizieren, die anschließend in weiterführenden pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Studien untersucht werden können.
Reverse-Screening-Experiment
Das Reverse-Screening ist eine Screening-Methode, um Nicht-Zielmoleküle schnell aus einer großen Anzahl von Kandidatenmolekülen auszuschließen. Es dient dazu, Moleküle zu eliminieren, die die gewünschte Eigenschaft oder Funktion nicht besitzen. Der Schlüssel zum Erfolg liegt in der Auswahl geeigneter Marker oder Bedingungen, die es ermöglichen, Nicht-Zielmoleküle während des Screening-Prozesses zu identifizieren und zu entfernen. In diesem Experiment ist die Auswahl der Nicht-Zielmoleküle von entscheidender Bedeutung. Es muss sichergestellt werden, dass die ausgewählten Nicht-Zielmoleküle repräsentativ für Substanzen sind, die das Aptamer-Screening stören könnten, und dass mögliche Störfaktoren möglichst umfassend abgedeckt sind.
Experiment zur kompetitiven Hemmung
Durch Zugabe eines Überschusses an Konkurrenten (z. B. Moleküle mit ähnlicher Struktur wie das Zielmolekül) zum Bindungssystem des Aptamers und des Zielmoleküls lässt sich die Veränderung der Bindungsfähigkeit des Aptamers an das Zielmolekül beobachten. Eine signifikante Verringerung der Bindungsfähigkeit des Aptamers an das Zielmolekül deutet auf eine hohe Spezifität des Aptamers hin.
In manchen Fällen können kompetitive Hemmexperimente als Bestandteil oder Ergänzung zu Reverse-Screening-Experimenten eingesetzt werden. Beispielsweise kann im Rahmen des Arzneimittel-Screenings die Bindungsfähigkeit eines Wirkstoffmoleküls an das Zielprotein mittels kompetitiver Hemmexperimente untersucht werden. Anschließend können Reverse-Screening-Experimente verwendet werden, um Verbindungen zu eliminieren, die zu stark an normale Zellen oder Gewebe binden.
Aptamer-Zytotoxizitätsanalyse
Für die Analyse der Zytotoxizität von Aptameren stehen verschiedene experimentelle Methoden zur Verfügung, die dazu dienen, die Auswirkungen von Aptameren auf das Überleben, die Proliferation oder die Funktion von Zellen zu bewerten.
| Methoden | Detaillierte Einführung | Vorteil | Nachteil |
|---|---|---|---|
| MTT-Nachweismethode | Der MTT-Test ist eine Methode, die auf der Enzymaktivität in den Mitochondrien lebender Zellen basiert. Die Succinatdehydrogenase in den Mitochondrien lebender Zellen kann exogenes MTT zu dem wasserunlöslichen, blauvioletten Kristall Formazan reduzieren und in der Zelle einlagern. Tote Zellen besitzen diese Funktion nicht. Durch Auflösen dieser Kristalle mit Dimethylsulfoxid (DMSO) und anschließende Messung der Absorption bei spezifischen Wellenlängen (z. B. 490 nm oder 570 nm) in einem Enzymatometer lässt sich indirekt die Anzahl lebender Zellen bestimmen und somit die Zytotoxizität des Aptamers beurteilen. | Hohe Empfindlichkeit, Wirtschaftlichkeit und Komfort | Hohe Arbeitsbelastung und organische Lösungsmittel können Zellen schädigen; es können nur die endgültigen experimentellen Ergebnisse erzielt werden, der vollständige Prozess der Zytotoxizität kann nicht beobachtet werden. |
| CCK-8-Nachweismethode | Der Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ist eine hochempfindliche, nicht-radioaktive kolorimetrische Nachweismethode. CCK-8 enthält WST-8, das durch Dehydrogenasen in den Mitochondrien lebender Zellen zu dem gut wasserlöslichen, orangefarbenen Methylzan-Farbstoff reduziert wird. Die Menge des gebildeten Methylzan-Farbstoffs korreliert linear mit der Anzahl lebender Zellen. Diese kann indirekt über die Messung der Lichtabsorption des Methylzan-Farbstoffs bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt werden, um so die Zytotoxizität des Aptamers zu bewerten. | Einfache Handhabung, keine Zellwäsche erforderlich, schnelle Detektion, großer linearer Detektionsbereich, hohe Empfindlichkeit, gute Wiederholbarkeit, geringe Zytotoxizität | Hoher Reagenzienpreis; Es ist manchmal schwierig zu erkennen, ob die verringerte Absorption auf eine Abnahme der Anzahl lebender Zellen oder auf eine verminderte Aktivität der zellulären Dehydrogenase selbst zurückzuführen ist. |
| LDH-Nachweismethode | LDH (Laktatdehydrogenase) ist ein Enzym, das im Zytoplasma von Zellen stabil ist. Bei Beschädigung der Zellmembran wird LDH aus der Zelle freigesetzt. LDH katalysiert die Umwandlung von Milchsäure zu Pyruvat und reagiert mit Tetrazoliumsalzen (INT) zu einer violetten, kristallinen Substanz. Durch Messung ihrer Absorption bei einer spezifischen Wellenlänge (z. B. 490 nm) lässt sich der Grad der Zellschädigung bestimmen und somit die Zytotoxizität des Aptamers bewerten. | Es spiegelt direkt die Sterberate der Zellen wider, schädigt die Zellen weniger und führt nicht zu einer Kontamination mit radioaktiven Isotopen. | Da die Zellen häufig aus dem Inkubator entnommen werden müssen, ist die Durchführung komplizierter; es können lediglich die endgültigen experimentellen Ergebnisse erzielt werden, der vollständige Prozess der Zytotoxizität kann nicht beobachtet werden. |
| Echtzeit-Lebendzellbildanalyse | Mithilfe eines Echtzeit-Lebendzell-Imaging-Analysators wurde das Gerät im Inkubator platziert, um den gesamten Zellwachstumszyklus in Echtzeit zu beobachten und aufzuzeichnen. Die Zytotoxizität von Aptameren kann durch die Analyse morphologischer Veränderungen und Wachstumskurven der Zellen bewertet werden. Diese Methode liefert Video- und quantifizierte Ergebnisse zytotoxischer Prozesse bei gleichzeitig stabiler Zellwachstumsumgebung. | Es ermöglicht die Echtzeitüberwachung des zytotoxischen Prozesses mittels zerstörungsfreier Bildgebung, wodurch Störungen und Schäden an den Zellen reduziert werden; sowohl Video- als auch quantifizierte Ergebnisse stehen für eine eingehende Analyse zur Verfügung. | Die Ausrüstungskosten sind hoch und erfordern professionelle Bedienungskenntnisse sowie Datenanalysefähigkeiten. |
KACHI
Vorteile des Aptamer-Forschungsdienstes
Totale Qualitätskontrolle
Optimierte Aptamere mit höherer Stabilität
Wirtschaftlich und effizient. Wettbewerbsfähigerer Preis, besserer Service.
Umfassende Forschungsseiten und vielfältige Forschungsmethoden
Professionelle Beratung vor dem Kauf und Kundendienst
Umfangreiche Erfahrung in der Aptameranalyse
Hochrangiges Forschungs- und Entwicklungsteam
Kundenspezifische Dienstleistungen im Zusammenhang mit Aptameren
Bei Fragen können Sie sich jederzeit gerne an uns wenden.
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