Technischer Prozess der Aptamersynthese

Grundprinzip und technologischer Prozess

Bei der Nukleinsäure-Aptamer-Synthese wird eine Bibliothek einzelsträngiger Oligonukleotide in vitro chemisch synthetisiert, mit der Zielsubstanz vermischt und ein Komplex aus Zielsubstanz und Nukleinsäure gebildet. Nicht bindende Nukleinsäuremoleküle werden abgewaschen, und die bindenden Nukleinsäuremoleküle werden isoliert. Diese dienen als Matrizen für die PCR-Amplifikation im nächsten Screening-Durchgang. Durch wiederholtes SELEX-Screening und Amplifikation werden DNA- oder RNA-Moleküle, die nicht oder nur schwach bzw. mäßig an die Zielsubstanz binden, abgewaschen. Aptamere – also DNA- oder RNA-Moleküle mit hoher Affinität zur Zielsubstanz – werden aus der großen, ungeordneten Bibliothek isoliert. Ihre Reinheit steigt mit dem SELEX-Prozess, bis sie schließlich einen Großteil der Bibliothek ausmachen.

Der SELEX-Screening-Prozess von Nukleinsäure-Aptameren beginnt mit der Erstellung chemisch synthetisierter, zufälliger Oligonukleotidbibliotheken. Diese Bibliotheken zeichnen sich durch eine hohe Kapazität und Diversität aus. Theoretisch beträgt die Bibliothekskapazität 4ⁿ, wenn die zufällige Sequenz eines Oligonukleotids aus n Basen besteht. Künstliche Modifikationen der Bibliothek erhöhen die Diversität der zufälligen Sequenzen. Üblicherweise umfassen die in SELEX-Experimenten verwendeten zufälligen Oligonukleotidsequenzen 30 Basen, wodurch die Bibliothekskapazität bis zu 10¹⁸ Basen erreichen kann. Diese hohe Bibliothekskapazität ist entscheidend für das SELEX-Screening hochaffiner Liganden. Da die Konzentration der synthetischen Bibliotheken jedoch festgelegt ist, verringern zu lange zufällige Sequenzen die Häufigkeit der einzelnen Oligonukleotide in den Bibliotheken und somit die Wahrscheinlichkeit, ein spezifisches Aptamer im SELEX-Screening zu finden. Im Allgemeinen kann die Bibliothekskapazität von 10^13 bis 10^15 in der ersten Runde des Selex-Screenings den praktischen Anforderungen genügen.

Abb. 1 SELEX-Verfahren