1960 wurde das Konzept der bispezifischen Antikörper eingeführt. Bispezifische Antikörper, auch bekannt als bispezifische monoklonale Antikörper, sind künstlich hergestellte Antikörper, die mithilfe gentechnischer Verfahren synthetisiert werden. Als gentechnisch veränderte Antikörper gehören bispezifische Antikörper üblicherweise zur IgG-Subklasse und enthalten ein Antigenbindungsfragment, das auf die CD3-Untereinheit abzielt. Bispezifische Antikörper besitzen zwei spezifische Antigenbindungsstellen, die gleichzeitig zwei verschiedene Antigene oder zwei verschiedene Epitope eines Antigens binden und erkennen können. Im Vergleich zu monoklonalen Antikörpern verfügen bispezifische Antikörper über eine zusätzliche spezifische Antigenbindungsstelle und weisen daher eine höhere Spezifität und Zielgenauigkeit auf. Dies ermöglicht eine präzisere Zielsteuerung von Tumorzellen und reduziert die Toxizität gegenüber unerwünschten Ereignissen. Bispezifische Antikörper können gleichzeitig mehrere biologische Funktionen erfüllen, wie z. B. die Rekrutierung von Immunzellen, die Blockierung von Signalwegen und die direkte Abtötung von Tumorzellen. Frühe bispezifische Antikörper wurden hauptsächlich durch chemische Konjugation oder Zellfusion hergestellt. Diese Methode entwickelte sich jedoch aufgrund der zufälligen Kombination und der Schwierigkeit, die Zielkombination zu isolieren, nur langsam weiter. Mit der kontinuierlichen Weiterentwicklung der Gentechnik wurden viele neue Technologieplattformen entwickelt, wie zum Beispiel Knots-in-Hole (KIH), CrossMab, DVD Ig usw. Diese Plattformen lösen effektiv Probleme wie Fehlpaarungen zwischen schweren und leichten Ketten und verbessern die Gleichmäßigkeit und Ausbeute bispezifischer Antikörper.

Zu den wichtigsten Methoden zur Herstellung bispezifischer Antikörper zählen die chemische Kopplung, die Vier-Quellen-Hybridom-Methode und die gentechnische Antikörperpräparation. Bei der chemischen Kopplung werden zwei intakte IgG-Moleküle oder zwei F(ab')₂-Antikörperfragmente mithilfe von Kopplungsreagenzien wie Phthalimid und Dithioacylbenzoesäure zu bispezifischen Antikörpern verknüpft. Diese Methode ist einfach und unkompliziert, kann jedoch die Antigenbindungsstelle schädigen, die Antikörperaktivität verringern und das Kopplungsreagenz selbst birgt ein gewisses karzinogenes Potenzial. Die Vier-Quellen-Hybridom-Methode basiert auf der Fusion somatischer Zellen zweier verschiedener Hybridomzelllinien zur Expression des entsprechenden Maus-IgG. Mittels Gentechnik können Antikörper gentechnisch so verändert werden, dass bispezifische Antikörper entstehen. Dazu werden zwei verschiedene monoklonale Antikörper konstruiert und die Fab-Fragmente bzw. die variablen Regionen der schweren und leichten Kette separat abgespalten. Durch Vernetzung oder Kettenrekombination werden die beiden Fragmente zu einem bispezifischen Antikörper kombiniert. Obwohl die Gentechnik relativ komplex ist, stellt sie derzeit die gängigste Methode zur Herstellung bispezifischer Antikörper dar, um deren Struktur und Funktion anzupassen. Beim Design bispezifischer Antikörper kann das Prinzip der Antikörper-Kreuzreaktivität genutzt werden. Da diese jedoch unspezifische Reaktionen hervorrufen kann, muss sie bei der praktischen Anwendung bispezifischer Antikörper, beispielsweise in der Therapie, sorgfältig berücksichtigt werden.

Die Reinigung bispezifischer Antikörper ist der Prozess der Isolierung und Aufreinigung hochreiner Zielantikörper. Zwei Methoden, Zentrifugation und Tiefenfiltration, werden eingesetzt, um lösliche Verunreinigungen zu entfernen. Der Zielantikörper wird zunächst mittels Affinitätschromatographie gebunden. Für IgG-ähnliche bispezifische Antikörper wird Protein-A-Affinitätschromatographie verwendet, während für nicht-IgG-ähnliche bispezifische Antikörper eine auf der leichten Kette basierende Affinitätschromatographie zum Einsatz kommt. Anschließend wird der Antikörper für eine bestimmte Zeit unter sauren Bedingungen inkubiert. Dadurch wird die Proteinstruktur auf der Oberfläche der Virushülle zerstört, wodurch die Infektionsfähigkeit verloren geht. Eine Zwischenfiltration dient der weiteren Entfernung von Verunreinigungen wie Wirtszellproteinen (HCP). Die Reinheit der Antikörper wird durch Methoden wie Ionenaustauschchromatographie weiter verbessert, und verbleibende Viren werden mittels Nanofiltration oder Ultrafiltration entfernt. Abschließend wird die Probe konzentriert und durch einen geeigneten Puffer ersetzt.