Der Bakteriophage M13 gehört zur Gruppe der filamentösen Phagen, die als Ff-Phagen bezeichnet werden. Er ist 900 nm lang und 6,5 nm breit. Sein Genom besteht aus einzelsträngiger DNA (ssDNA) mit einer Länge von 6407 bp und kodiert für neun Gene, die elf verschiedene Proteine ​​enthalten. Fünf dieser Proteine ​​sind Hüllproteine, die übrigen sechs sind an der Replikation und dem Zusammenbau des Phagen beteiligt. Das Kapsidprotein G8P, das aus etwa 2700 Proteineinheiten besteht, ist das am häufigsten vorkommende Hüllprotein und bildet eine Hülle um das Chromosom.

Abb. 2 Schematische Darstellung des Bakteriophagen M13.(Referenz: Grundlagen der Antikörper-Phagen-Display-Technologie)

Seit 1990 werden verschiedene Antikörperformate zur Erstellung von Phagenbibliotheken verwendet, darunter VHs, VHHs, scFvs, Diabodies und Fab-Antikörper. Die aus den Strukturdomänen VH und VL bestehenden scFv sind Einzelkettenantikörper, die zur Erstellung von scFv-Antikörperbibliotheken eingesetzt werden. scFv zeichnen sich durch eine kurze Halbwertszeit und geringe Immunogenität aus. Fab-Antikörperbibliotheken bestehen aus VH, VL, CL und CH1 und ermöglichen ein schnelles Screening idealer Antikörper mit hoher Affinität. Die kleinste Einheit, die an das Zielantigen binden kann – VHH – bildet die Grundlage aktueller Nanobody-Bibliotheken. VHH bietet die Vorteile einer einfachen Struktur, eines geringen Volumens, hoher Löslichkeit, guter Stabilität sowie einfacher Herstellung und Expression. Synthetische Nanobody-Bibliotheken (Nb-Bibliotheken) etablieren sich als attraktive Alternative zur Immunisierung von Tieren, da sie stabile, hochaffine synthetische Nanobody liefern. Im Allgemeinen werden diese Antikörperfragmente mit dem G3P des M13-Phagen fusioniert, und durch Klonierung einer großen Anzahl von Genen, die für ein Antikörperfragment kodieren, können große Phagen-Display-Antikörperbibliotheken erzeugt werden, aus denen viele verschiedene Antikörper ausgewählt werden können.

Nach Abschluss der Immunisierung wurde der Titer bestimmt und nach Erreichen der Titergrenze Blutproben von den Tieren entnommen. Aus dem Blut wurden Lymphozyten isoliert, RNA extrahiert, das Zielfragment mittels RT-PCR amplifiziert und das V-Region-Genfragment gewonnen. Die Amplifikation des V-Gens erfolgte mit einem spezifischen Primer.

Die so erzeugten natürlichen Bibliotheken enthalten schwach immunogene Antikörper von Tieren, die jedes beliebige Ziel angreifen können. Phagenantikörper, die spezifisch an das Antigen binden, können mithilfe von Screening-Verfahren gewonnen werden, die das Antigen fixieren oder markieren.

Das Zielantigen wird an einen festen Träger, beispielsweise eine Mikrotiterplattenvertiefung, gebunden oder an ein magnetisches Kügelchen gekoppelt. Anschließend wird die Phagen-Antikörper-Bibliothek hinzugefügt, um an das Antigen zu binden. Nach mehreren Elutionsschritten werden die Phagen mit geringer Affinität oder unspezifische Phagen abgewaschen, während die Phagen, die spezifische Antikörper präsentieren, zurückgehalten werden.