Phagen-Display-Bibliotheks-Screening-Service

Alpha Lifetech beschäftigt sich seit vielen Jahren intensiv mit der Phagen-Display-Technologie. Das Unternehmen hat eine ausgereifte und stabile Plattform für diese Technologie entwickelt, die Zeit bei der wissenschaftlichen Forschung und Projektentwicklung spart und die anschließende Produktion erleichtert. Alpha Lifetech bietet seinen Kunden außerdem Dienstleistungen wie die Produktion von vhh-Antikörpern, scFv-Antikörpern und Fab-Antikörpern an.

Alpha Lifetech verfügt über eine umfassende M13/T7-Phagen-Display-Plattform zur Erstellung und Produktion von Antikörperbibliotheken. Darüber hinaus bieten wir kundenspezifische Dienstleistungen wie die Herstellung von Antikörper-scFvs und das Hochdurchsatz-Antikörper-Screening an, um Ihren Bedürfnissen gerecht zu werden.

Konstruktionsprozess einer Phagen-Display-Bibliothek

Die Konstruktion der Phagenbibliothek erfolgt wie folgt: Spezifische Primer werden für die PCR-Amplifikation entworfen, deren Produkte enzymatisch mit dem T7/M13-Phagenvektor ligiert werden. Dadurch wird das rekombinante Phagenplasmid erfolgreich konstruiert. Dieses wird in TG1-Rezeptorzellen transformiert, anschließend auf einem Medium mit geeigneten Antibiotika beschichtet und nach Selektion transformierender Zellen expandiert. Nach mehreren Kulturzyklen replizieren sich die Phagen in den Bakterien und exprimieren das Zielprotein bzw. -polypeptid. Abschließend wird die Phagenbibliothek aufgereinigt, um Verunreinigungen und ungebundene Phagen zu entfernen.

Methoden zum Screening von Phagen-Display-Bibliotheken

Der Erfolg der Phagen-Display-Antikörperproduktion hängt maßgeblich von den Antikörper-Phagen-Display-Bibliotheken ab. Gängige Methoden des Phagen-Pannings sind das Festphasen- und das Flüssigphasen-Screening. Beim Festphasen-Antigen-Screening werden spezifische Antikörper durch 3–4 Elutionsrunden angereichert, um Antikörper-Phagen-Display-Bibliotheken zu erhalten. Beim Flüssigphasen-Antigen-Screening werden biotinmarkierte Zielmoleküle und Antikörper-Phagen-Display-Bibliotheken inkubiert und die gebundenen Phagen mithilfe von Magnetpartikeln isoliert. Das Festphasen-Screening verbraucht mehr Antigen, und einige Antigen-Epitope werden zerstört. Das Flüssigphasen-Screening zeichnet sich durch hohe Effizienz und Anreicherung aus, die erhaltenen Antikörper sind jedoch weniger spezifisch. Die Wahl der Phagen-Panning-Methode hängt von den jeweiligen experimentellen Anforderungen ab und beeinflusst somit die Effektivität der Phagen-Display-Antikörperproduktion.

Hochdurchsatz-Antikörper-Screening

Die Antikörperentwicklung hat in der modernen Medizin rasant an Fahrt aufgenommen. Es existieren verschiedene Methoden zur Antikörperentwicklung, wobei das Hochdurchsatz-Antikörper-Screening in der medizinischen Forschung am häufigsten eingesetzt wird. Dieses Verfahren ermöglicht die Gewinnung einer großen Vielfalt an Antikörperrepertoires. Die Kombination mit traditionellen Methoden zum Screening von Antikörperbibliotheken kann die Screening-Qualität von Phagen-Display-Bibliotheken verbessern. Nach dem biologischen Screening können die Antikörper mittels Niedrigdurchsatz-ELISA oder Hochdurchsatz-Antikörper-Screening charakterisiert werden.

Abb. 1 Flussdiagramm zur Darstellung der Abfolge der Ereignisse von der Erstellung von Phagen-Antikörper-Bibliotheken bis zur Generierung monoklonaler Antikörper mit hoher Affinität zu Antigenen und geringer Immunogenität.(Referenzquelle: Phagen-Display-Technologie als leistungsstarke Plattform für die Antikörper-Wirkstoffforschung - PMC (nih.gov))

Vorsichtsmaßnahmen für das Antikörper-Phagen-Display-ScreeningVorsichtsmaßnahmen

Pufferüberlegungen

Bei der Auswahl der Puffer sollten die Stabilität des Zielproteins, die Bindungsumgebung und eine minimale unspezifische Bindung im jeweiligen Anwendungsszenario berücksichtigt werden. Nicht verwandte Proteine, nichtionische Detergenzien und physiologische Salzkonzentrationen tragen zur Reduzierung des Hintergrunds bei. Weitere Bedingungen können die Zugabe zweiwertiger Kationen oder anderer Cofaktoren zum Puffer erfordern. Protein-Cofaktoren können zusammen mit dem Zielprotein fixiert, dem Sortierpuffer zugesetzt oder sogar zur Anreicherung des Zielproteins verwendet werden.

Druckbetrachtungen

Zu den üblicherweise berücksichtigten Faktoren des Selektionsdrucks gehören die Konzentration der Zielmoleküle, die Bindungszeit, die Waschintensität usw. Weitere Techniken zur Erhöhung des Selektionsdrucks umfassen die Verwendung von Denaturierungsmitteln (wie Säuren, Harnstoff und Guanidin), organischen Lösungsmitteln, die Erhöhung der Temperatur oder die Erhöhung der Konzentration konkurrierender Liganden oder Zielmoleküle im Waschpuffer.
Dabei ist die erste Screening-Runde von entscheidender Bedeutung. In dieser ersten Runde geht es darum, möglichst viele positive Klone aus der erstellten Bibliothek zu isolieren und gleichzeitig unspezifische Klone zu entfernen. Um die Diversität der Bibliothek zu erhalten, sollten porös beschichtete oder zahlreiche lösliche Zielmoleküle verwendet werden, die eine große Anzahl gebundener Phagen erfassen. In den folgenden Screening-Runden sollte der Selektionsdruck durch verstärkte Anreicherung, mehrfaches Waschen und längere Waschzeiten erhöht werden, um Klone mit hoher Affinität zu identifizieren.

Negative Screening-Strategie

Beim Screening von Antigen-Tags und Trägermaterialien werden alle Substanzen auf den Antigenkonjugaten, wie Tags, Fusionsproteine und Trägersubstrate, untersucht. Durch das negative Screening von Nicht-Zielantigenen kann die Anreicherung von Antikörpern, die nicht gegen das Zielantigen gerichtet sind, begrenzt werden.
Ganze Zellen, Liposomen, Nanophospholipid-Discs und VLPs können bei der Untersuchung transfizierter Zelllinien mittels eines Negativscreenings mit simulierten transfizierten Zellen oder nicht transfizierten Zellen untersucht werden.
Entfernung komplexer Antigenmischungen Für unbekannte oder komplexe Zielmoleküle, wie z. B. ganze Zellen oder unreine Proteine, kann ein striktes Negativscreening durchgeführt werden.
Die Strategie von Antikörpern gegen spezifische Stellen von Antigenen besteht zum einen darin, den Antikörper, der mit dem Liganden konkurrieren kann, durch Zugabe einer hohen Konzentration von Liganden zu eluieren, und zum anderen darin, den Antikörper zu blockieren.

Anwendung von Phagen-Display

Die Antikörperforschung hat in der modernen Medizin zunehmend an Bedeutung gewonnen. Es existieren verschiedene Ansätze zur Antikörperforschung, wobei die Phagen-Display-Technologie in der medizinischen Wissenschaft am häufigsten eingesetzt wird. Seit 1990 werden verschiedene Antikörperformate zur Erstellung von Phagenbibliotheken verwendet, darunter VHs, VHHs, scFvs, Diabodies und Fab-Antikörper.
*Phagenpeptidbibliotheken ermöglichen die schnelle Bestimmung der Sequenz von Proteinepitopen und haben sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Epitopen und Antigenrezeptoren entwickelt.
*Antikörperfragmente werden mit dem G3P des M13-Phagen fusioniert, und durch Klonierung einer großen Anzahl von Genen, die für ein Antikörperfragment kodieren, können große Phagen-Display-Antikörperbibliotheken erzeugt werden, aus denen viele verschiedene Antikörper ausgewählt werden können.
*Das T7-Phagen-Display-System bietet viele Vorteile, darunter Einfachheit, hohe Sicherheit, Stabilität, einfache Lagerung und Transport, weshalb das System in präventiven und therapeutischen Impfstoffen eingesetzt wird.
*Das T7-Phagen-Display-System kann verschiedene Antigene nachweisen, wie z. B. Oberflächenantigene pathogener Mikroorganismen und Krebsantigene.

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