Protein-Protein-Interaktionsanalyse-Service

Alpha Lifetech bietet seinen Kunden außerdem Proteinanalysen, Proteininteraktionsanalysen, Protein-Protein-Interaktionsanalysen (CO-IP, Western Blot, Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse) und Proteinfunktionsanalysen an, um den experimentellen Bedürfnissen verschiedener Kunden gerecht zu werden.

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Protein-Protein-Interaktionsanalyse-Service

Alpha Lifetech beschäftigt sich seit vielen Jahren intensiv mit Proteinanalysen, hat eine solide Plattform für Proteinfunktionsanalysen aufgebaut und beherrscht eine Vielzahl technischer Mittel zur Überprüfung von Proteininteraktionen, die wissenschaftliche Forschungs- oder Projektforschungszeit sparen und gleichzeitig stabile Ergebnisse liefern können.

Einführung in den Protein-Protein-Interaktionstest

Proteine sind die wichtigsten ausführenden Moleküle in allen Lebensformen und reagieren auf die in der Genetik gespeicherten Anweisungen. Häufiger erfüllen Proteine ihre Aufgaben, indem sie als Rollenspieler fungieren und mit anderen Proteinen interagieren. Dies wird besonders deutlich, wenn die Funktion eines Proteins im realen Kontext einer Zelle untersucht wird. Die Identifizierung von Proteininteraktionen ist für die biochemische Untersuchung eines einzelnen Proteins von entscheidender Bedeutung. Häufige Arten der Proteininteraktionsanalyse sind:

Co-Immunpräzipitations-Assay

Das Prinzip der Co-Immunpräzipitationsmethode besteht darin, das Zielprotein, spezifische Antikörper und Protein A/G-Magnetpartikel zu mischen und zu inkubieren. Der Überstand mit dem ungebundenen Protein wird durch Adsorption der Magnetpartikel an einem Magnetständer entfernt, und die Magnetpartikel werden gewaschen, um das Protein und andere Verunreinigungen zu entfernen, sofern sie nicht spezifisch gebunden sind.

Abb. 1 Schematische Darstellung von Co-IP-Assays.(Referenzquelle: Co-Immunpräzipitations-Assay - PubMed (nih.gov))

Pull-down-Assay

Beim Pull-Down-Assay wird das bekannte Protein an ein magnetisches Kügelchen gebunden und die zu detektierende Substanz hinzugegeben. Das Eluat wird auf die Adsorption interagierender Proteine untersucht.

1988 reinigten Smith et al. ein GST-Fusionsprotein, das in Pull-Down-Assays eingesetzt wurde und als Gst-Pull-Down bezeichnet wird. Dabei wird dem Zielprotein ein GST-Tag hinzugefügt, das interagierende Protein über GSH eingefangen, die Bindung eluiert und diese anschließend mittels Western Blot (WB) überprüft.

Abb. 2 Schematische Darstellung von GST-Pull-Down-Assays.(Referenzquelle: GST-Pull-Down-Assay zur Untersuchung der PIF4-Bindung in vitro - PubMed (nih.gov) )

Seine Pull-Down-Methode besteht darin, Metallionen wie Nickel oder Kobalt als Medium zu verwenden, das Protein mittels Affinitätschromatographie zu reinigen und die Bindung durch WB-Experiment zur Verifizierung zu eluieren.

Darüber hinaus gibt es DNA-Pull-down-Assays (Protein-DNA-Bindungsassay), RNA-Pull-down-Assays (Protein-RNA-Interaktionsassay) und Pull-down-Assays für kleine Moleküle.

Der DNA-Pull-Down-Assay (Protein-DNA-Bindungsassay) ist eine In-vitro-Methode zur Bestimmung der DNA-Bindung von Proteinen. Mittels Western-Blot-Analyse (WB) wird nachgewiesen, ob spezifische Proteine an Ziel-DNA binden. Unbekannte DNA-Fragmente, die an Proteine binden, werden mittels Massenspektrometrie (MS) identifiziert.

Der RNA-Pull-Down-Assay (Protein-RNA-Interaktionstest) ist eine In-vitro-Methode zur Bestimmung der RNA-Bindung an Proteine. Die Bindung spezifischer Proteine an die Ziel-RNA wird mittels Western Blot (WB) nachgewiesen; unbekannte, an Proteine gebundene RNA-Fragmente werden mittels Massenspektrometrie (MS) identifiziert.

Mit SM-Pull-Down-Assays (Small Molecule Pull-Down-Assays) lassen sich Zielproteine finden, die spezifisch an kleine Moleküle binden. In Kombination mit MS können solche Zielproteine präzise identifiziert werden. Man kann zwischen In-vitro-Markierungsmethoden und biologischen orthogonalen Methoden unterscheiden.

WB-Experiment

Der Western Blot (auch bekannt als WB-Experiment) basiert auf der spezifischen Reaktion von Antigen und Antikörper. Das Grundprinzip besteht darin, denaturierte Proteine mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufzutrennen und sie anschließend durch Membrantransfer (nass oder halbtrocken rotierend) auf einen Festphasenträger (z. B. PVDF- oder NC-Membran) zu übertragen. Nach dem Blockieren (mit BSA, Buttermilch etc.) wird der primäre Antikörper aufgetragen, der spezifisch an das Protein bindet. Nach dem Waschen des Films wird der fluoreszenzmarkierte sekundäre Antikörper hinzugegeben. Durch die Bindung des sekundären Antikörpers an den primären Antikörper kann das Zielprotein mittels Farbentwicklung des Substrats und Chemilumineszenz sichtbar gemacht werden. Der Western Blot wird üblicherweise verwendet, um festzustellen, ob ein bestimmtes Protein in der Probe exprimiert wird und um dessen Expressionsstärke grob zu analysieren.

Vergleich der Methoden zur Protein-Protein-Interaktion

Protein-Pull-Down-Assays ähneln Co-Immunpräzipitations-Assays (Co-IP), die beide zur Untersuchung von Proteininteraktionen beitragen. Der Unterschied zwischen den beiden Methoden besteht darin, dass Co-IP-Assays Interaktionspartner bekannter Proteine identifizieren, was zwar eine gewisse Authentizität gewährleistet, aber keine Aussage darüber zulässt, ob die Interaktion direkt oder indirekt erfolgt. Pull-Down-Assays hingegen dienen dem Nachweis unbekannter Proteine, die mit bekannten Proteinen interagieren. Sie bestätigen zwar direkt die Interaktion zwischen bekannten und nachgewiesenen Proteinen, geben aber keine Auskunft über die Bindungsverhältnisse in vivo.

Die Co-Immunpräzipitationstechnologie wird zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehr Proteinen auf Basis von Immunpräzipitationsexperimenten eingesetzt. Im Vergleich zu anderen experimentellen Techniken zur Analyse von Proteininteraktionen (GST Pull-down, Western Blot, Chromatin-Immunpräzipitations-Assay usw.) zeichnet sich die Co-IP-Technologie durch höhere Spezifität, Sensitivität und Reproduzierbarkeit aus. Sie vermeidet Störungen durch unspezifische Bindungen und spiegelt die Interaktion von Proteinen im natürlichen Zustand wider.

	GST-Auswahl	Co-IP	WB
Vorteil	Einfache Bedienung Geeignet zur Reinigung verschiedener Proteine	Für die In-vivo-Interaktionsanalyse Es kann mit nachgeschalteten Proteinen identifiziert werden.	Hohe Spezifität Qualitative und quantitative In-vitro-Studien
Einschränkung	*Möglicherweise unspezifische Bindung Eine weitere Validierung der Interaktion ist erforderlich.	Starke Abhängigkeit von Antikörpern Es kann zu unspezifischen Bindungen kommen.	Zeitaufwendig Schwierig anzuwenden für die groß angelegte Proteinanalyse
Anwendungsbeispiel	Interaktionen identifizieren Gereinigter Proteinkomplex	*Signaltransduktion untersuchen Krankheitsmechanismus	Anschließende Analyse von Protein-Protein-, Protein-DNA- und Protein-RNA-Interaktionen