Hefe-Oberflächendisplay-Bibliotheks-Screening-Service

Alpha Lifetech ist spezialisiert auf die Erstellung von Hefe-Display-Bibliotheken und das Screening von Antikörperbibliotheken. Wir bieten unseren Kunden weltweit die Möglichkeit, verschiedene Hefe-Display-Bibliotheken zu generieren und diese auf hochaffine und spezifische Antikörper zu screenen. Mit einem Team aus erfahrenen Forschern, modernster Technologie und Ausrüstung können wir Hefe-Display-Bibliotheken erstellen, die auf ein breites Spektrum krankheitsrelevanter Proteine abzielen. Wir bieten Phagen-Display- und Hefe-Display-Technologien an, darunter Protein-, Small-Molecule- und Antikörper-Display.

Unsere Hefe-Display-Bibliotheken zeichnen sich durch hohe Kapazität und Diversität aus und bilden somit eine hervorragende Grundlage für das effektive Screening spezifischer Antikörpersequenzen. Wir können verschiedene Arten von Antikörper-Hefe-Display-Bibliotheken (IgG-, scFv-, VHH- und Fab-Antikörperbibliotheken), Proteinbibliotheken, Peptidbibliotheken, cDNA-Bibliotheken usw. nach Ihren Anforderungen erstellen. Darüber hinaus entwickeln wir Antikörperbibliotheken mit unterschiedlichen Eigenschaften, darunter Immunbibliotheken, natürliche Bibliotheken, synthetische Bibliotheken, halbsynthetische Bibliotheken und Bibliotheken mit Antikörpern gegen Krankheiten.

Einführung in das Hefe-Display-System

Die Oberflächenpräsentation von Hefezellen ist eine Methode zur Darstellung rekombinanter Proteine auf der Oberfläche von Hefezellen mittels Genfusion. Das gängigste System verwendet das Zielprotein, das mit dem C-Terminus der Aga2p-Untereinheit des Alpha-Lektins fusioniert ist. Diese Fusion besteht hauptsächlich aus Epitop-Tags an beiden Seiten des Zielproteins: dem N-terminalen 9-Aminosäuren-Hämagglutinin-Tag (HA) und dem C-terminalen 10-Aminosäuren-c-myc-Tag. Die 69 Aminosäuren lange Aga2p-Untereinheit bindet über zwei Disulfidbrücken an die 725 Aminosäuren lange Aga1p-Untereinheit des Alpha-Lektins. Aga1p ist über eine β-1,6-Glucan-Bindung kovalent an der Zellwand verankert. Dadurch wird das Zielprotein auf der Oberfläche der Hefezellen präsentiert und kann anschließend vom entsprechenden Liganden erkannt werden. Funktionelle Proteine werden mittels Durchflusszytometrie aus den Proteinbibliotheken isoliert.

Abb. 1: Prinzip der Oberflächenpräsentation von Hefe. (Abbildungsquelle: Anwendungen der Hefeoberflächendarstellung für das Protein-Engineering.)

Einführung in die Hefe-Oberflächenanzeigebibliothek

Die Hefe-Display-Sortierung basiert auf der Oberflächenpräsentation von Hefezellen und wird hauptsächlich zum Screening von Antikörperbibliotheken eingesetzt, die gegen Zelloberflächenproteine gerichtet sind. Aufgrund der geringen unspezifischen Bindung zwischen Hefezellen und anderen Zelloberflächen ermöglicht die biologische Selektion von Hefezellen das Screening großer Bindungsbibliotheken, um seltene Klone zu identifizieren.

Hefe-Oberflächendisplay-Bibliotheks-Screening-Service

Plasmide werden hergestellt und Hefezellen kultiviert. Anschließend wird die DNA, die für das Zielprotein kodiert, synthetisiert und in einen Hefeexpressionsvektor kloniert, der induzierbare Promotoren, Signalpeptide und Zielgene enthält, die mit Oberflächenexpressionsproteinen (z. B. Aga2p) fusioniert sind. Das Gen für das Zielprotein kann mit dem Gen für das Hefezellwandprotein (üblicherweise Aga2p) fusioniert werden. Das Fusionsgen wird dann mittels Elektroporation in Hefezellen transformiert. Nach der Transformation können Hefezellen, die Antikörpergene auf ihrer Oberfläche exprimieren, antigenspezifischen Screening-Tests unterzogen werden: Die Hefebibliothek wird mit dem Zielantigen inkubiert, und Hefezellen, die spezifisch daran binden, werden selektiert. Mithilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) werden Hefezellen isoliert, die Proteine mit den gewünschten Eigenschaften präsentieren. Das Screening der Hefeexpressionsbibliothek kann mit einer maximalen Bibliotheksgröße von ca. 10⁸–10⁹ Hefezellen durchgeführt werden. Positive Klone können anschließend für weitere Analysen oder nachfolgende Anwendungen isoliert werden. Sobald spezifische Antikörperklone aus der Antikörperbibliothek identifiziert sind, können sie weiter charakterisiert, massenhaft hergestellt und mit Techniken wie der Protein-A/G-Affinitätschromatographie gereinigt werden, um den gesamten Prozess des Hefe-Display-Screenings und der Antikörperproduktion abzuschließen.

Prozess der Hefe-Display-Bibliotheksprüfung

Abb. 2 Screening-Prozess der Hefe-Display-Bibliothek

Arbeitsablauf des Screening-Services für Hefe-Displaybibliotheken

Schritte	Serviceinhalte	Zeitleiste
Antigenpräparation	Antigentyp: Falls der Kunde Antigene bereitstellen kann, müssen entsprechende Proben je nach Typ geliefert werden: Rekombinante Proteine erfordern 3-3,5 mg mit einer Reinheit von über 85 %, kleine Moleküle müssen konjugiert sein und eine Reinheit von über 90 % aufweisen, Peptidsynthesen müssen konjugiert sein und eine Reinheit von über 90 % aufweisen, Probentypen wie Viren müssen inaktiviert sein, RNA muss auf Abbau geprüft werden, und die oben genannten Antigentypen können auch für die Synthese kundenspezifisch angepasst werden.	2-3 Wochen
Tierische Immunität	Die Anzahl der Tierimpfungen beträgt 5. Anhand der Serumtiterbestimmung muss entschieden werden, ob die Anzahl der Impfungen erhöht werden muss. Antigenimmunität: Protein-/Virus-Antigenpotenz > 10⁵; Peptid-/Kleinmolekül-Antigenpotenz > 10⁴	5-6 Wochen
cDNA-Präparation als Vorlage	PBMCs aus dem Plasma abtrennen, Gesamt-RNA extrahieren (RNA-Extraktionskit) und in cDNA umwandeln.	1 Tag
Bibliotheksbau	Unter Verwendung von cDNA als Vorlage wurde das VHH-Gen in zwei PCR-Zyklen amplifiziert und ein VHH-Gen-Splicing-Vektor für Hefezellen konstruiert. Dieser Vektor wurde mittels Elektroporation in Hefezellen transformiert, um eine Antikörperbibliothek zu erstellen. 48 Klone wurden zufällig ausgewählt und die Positivrate (>90 %) mittels PCR bestimmt. Die Bibliothekskapazität wurde auf 10⁷–10⁸ geschätzt. Die korrekte Insertionsrate (>90 %) und die Diversität der Bibliothek wurden mittels NGS-Sequenzierung ermittelt.	2 Wochen
Vorführung in der Bibliothek	Standardmäßig wurden drei Screening-Runden durchgeführt: Zunächst erfolgte ein FACS-Screening fluoreszenzmarkierter Proteine, gefolgt von einer NGS-Sequenzierung in der dritten Runde. Positive Klone wurden für die Expressionsanalyse mittels Einzelgraminduktion und den ELISA-Nachweis ausgewählt. Alle positiven Klone wurden für die Gensequenzierung ausgewählt, wobei verschiedene CDR-Region-Sequenzen selektiert wurden.	2-3 Wochen
Antikörperverifizierung	Die Konstruktion geeigneter Expressionsvektoren für Antikörpersequenzen kann die Antikörperexpression, die Antikörperreinigung, die ELISA- und BLI-Validierung der Antikörper-Antigen-Bindung zur Überprüfung der Antikörperaffinität sowie die Durchflusszytometrie-Blockade zur Validierung der Zellfunktion erleichtern.	1 Woche

Fallstudie zur Oberflächenanzeige in der Bibliothek von Hefen

In der Literatur zur Oberflächenpräsentation von Hefezellen zur schnellen Entdeckung konformationsselektiver Nanokörper etablierten die Autoren eine vollständige In-vitro-Plattform zur Nanokörper-Entdeckung auf Basis der Oberflächenpräsentation von Hefezellen. Zunächst wurde ausgehend von Kamelgenen eine synthetische Nanokörperbibliothek erstellt. Abbildung D zeigt, dass der Nanokörper am Carboxylende ein HA-Tag trägt und anschließend kovalent an die Hefezellwand gebunden wird. Abbildung E veranschaulicht den Screening-Prozess der Nanokörper. Hefezellen mit Antigen-Affinität zu Nanokörpern wurden isoliert, amplifiziert und mittels FACS wiederholt auf Antikörper selektiert. Mithilfe dieser Plattform entdeckten die Autoren konformationsselektive Nanokörper, die auf zwei verschiedene humane GPCRs abzielen.