La tecnología de visualización de fagos consiste en insertar el gen diana extraño en una posición específica de la proteína de la cápside del fago y expresarlo en su superficie sin afectar su función normal. Tras varias rondas de selección, se obtuvo finalmente la proteína diana con alta especificidad y elevada actividad biológica.

Mediante esta tecnología se pueden generar bibliotecas de anticuerpos de alta capacidad. El ciclo de cribado es breve, el proceso operativo es sencillo y el abanico de aplicaciones es amplio, lo que permite identificar secuencias óptimas para péptidos o proteínas específicos. En aplicaciones relacionadas con virus, los investigadores pueden descubrir anticuerpos que se unen a epítopos virales clave mediante el cribado de grandes bibliotecas de anticuerpos. Este proceso puede impedir la entrada, la replicación o los mecanismos de evasión inmunitaria de los virus, sentando así las bases para el tratamiento de enfermedades.

La tecnología de visualización de fagos se utiliza con mayor frecuencia que la tecnología de hibridomas, la cual se limita a producir una pequeña cantidad de anticuerpos contra inmunógenos específicos. En cambio, la tecnología de visualización de fagos permite presentar una biblioteca completa de anticuerpos derivados de diversas especies inmunitarias.

La tecnología de visualización de fagos tiene una amplia gama de aplicaciones, que incluyen la detección de receptores de microorganismos patógenos, el estudio de interacciones proteicas, el seguimiento de la transmisión de señales entre células, el diagnóstico de enfermedades animales y el desarrollo de vacunas, entre otros campos.

La tecnología de visualización de fagos ofrece numerosas ventajas y puede aplicarse en diversos campos. Sin embargo, el principal desafío en el desarrollo de anticuerpos recombinantes mediante este método radica en la complejidad y el coste del proceso. Este enfoque requiere la integración de técnicas de biología molecular, como mutación, clonación y expresión, junto con análisis inmunológicos, bioquímicos y biofísicos para identificar y caracterizar los anticuerpos deseados.

La presentación de antígenos es un eslabón muy importante. Los métodos de presentación de antígenos incluyen principalmente la presentación de antígenos recubiertos directamente, la presentación de antígenos recubiertos indirectamente, la presentación de antígenos mediante cribado de células completas, la presentación de antígenos mediante liposomas, discos de nanofosfolípidos y VLPs.

El método de recubrimiento directo es relativamente sencillo, pero la conformación del antígeno es fácilmente modificable. El recubrimiento indirecto, si bien es complejo, permite mantener la conformación del antígeno y mejorar la eficiencia de presentación. La selección celular puede simular el entorno real in vivo, pero presenta el problema de la unión inespecífica. El disco de nanofosfolípidos posee un tamaño reducido, alta eficiencia de administración y buena estabilidad. Las VLP se fusionan o recubren con antígenos, lo que les confiere alta inmunogenicidad y seguridad, y puede desencadenar una fuerte respuesta inmunitaria.

Si la concentración es demasiado baja, la probabilidad de unión con el fago disminuirá, lo que reducirá la eficiencia de la detección. Por el contrario, una concentración excesivamente alta puede aumentar la probabilidad de unión inespecífica, elevar la señal de fondo y dificultar la identificación de clones positivos.

Se puede emplear un método de fijación suave para evitar altas temperaturas, ácidos fuertes y álcalis. Se utilizaron métodos de recubrimiento indirecto y el sistema biotina-estreptavidina para reducir el daño a la estructura del antígeno. Si el antígeno es una proteína de membrana, se puede presentar en la superficie de células intactas o utilizar para simular el entorno de la membrana, como en el caso de los nanodiscos, para mantener su conformación natural de proteína de membrana.

Además de los experimentos rutinarios como ELISA, Western Blot (WB) e inmunofluorescencia (IF), se pueden emplear técnicas de detección como la resonancia de plasmones superficiales (SPR) y la interferometría de capas biológicas (BLI) para monitorizar los procesos de unión y disociación de anticuerpos y antígenos en tiempo real, lo que permite determinar la afinidad y los parámetros cinéticos.

La técnica de presentación en fagos puede utilizarse para generar anticuerpos monoclonales de alta afinidad para una amplia gama de especies productoras de anticuerpos, entre las que se incluyen, pero no se limitan a, humanos, ratones, ratas, conejos, pollos, camellos, alpacas, vacas, perros, ovejas, monos y tiburones.

La tecnología de construcción de bibliotecas de anticuerpos de ratón está bien establecida, es rentable y requiere poco tiempo de experimentación, lo que la hace idónea para la detección preliminar de anticuerpos y la investigación básica. Los anticuerpos de conejo presentan una fuerte afinidad y especificidad, con un rango de reconocimiento de epítopos más amplio que los de ratón. Los anticuerpos humanos pueden obtenerse directamente de bibliotecas de anticuerpos humanos, evitando así posibles reacciones inmunitarias que podrían ocurrir al administrar anticuerpos heterólogos al cuerpo humano. Este enfoque tiene un valor significativo en la investigación y el desarrollo de fármacos, en particular en la creación de anticuerpos terapéuticos.

Los inmunógenos animales se dividen generalmente en antígenos proteicos, antígenos polipeptídicos, antígenos de ácidos nucleicos y antígenos relacionados con patógenos, entre los cuales los antígenos relacionados con patógenos incluyen antígenos virales (partículas virales completas, proteínas virales, proteínas no estructurales del virus, etc.), antígenos bacterianos (extracto bacteriano completo, componentes de la pared celular, proteínas secretadas, toxinas, etc.) y antígenos parasitarios.

Ajustar los inmunógenos sustituyendo los antígenos inmunitarios por proteínas recombinantes y reemplazando las partículas virales extintoras por las proteínas estructurales de los virus. Ajustar el diseño experimental y modificar la dosis inmunitaria.

La inmunogenicidad puede potenciarse mediante la unión de antígenos a proteínas transportadoras, como la albúmina sérica bovina. Además, se pueden emplear adyuvantes inmunitarios, como el adyuvante de Freund y el adyuvante de aluminio, para prolongar el tiempo de permanencia in vivo y estimular la activación y proliferación de las células inmunitarias, mejorando así la inmunogenicidad.

Una biblioteca de anticuerpos de fagos es una colección de anticuerpos de fagos diversos, creada mediante el ensamblaje de un conjunto completo de genes de la región variable de anticuerpos en vectores de fagos y su expresión en la superficie de estos. Este proceso da como resultado la formación de una biblioteca de anticuerpos de fagos.

El proceso general de visualización de fagos comprende varios pasos clave: extracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de animales inmunizados, aislamiento del ARN total y su transcripción a ADN complementario (ADNc), amplificación del gen diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación del gen diana en un vector fágico y transformación del vector en una célula huésped para su expresión. Este proceso da como resultado la construcción de una biblioteca de visualización de fagos, que permite identificar rápidamente anticuerpos de alta afinidad. Posteriormente, esta biblioteca puede servir como un recurso valioso para el desarrollo de vacunas, fármacos terapéuticos y reactivos de diagnóstico.

Según el origen de la biblioteca de anticuerpos, estas se pueden clasificar en bibliotecas de anticuerpos de fagos inmunitarios y bibliotecas de anticuerpos de fagos nativos. La principal diferencia entre ambos tipos radica en si los animales han sido vacunados. Además, las bibliotecas de anticuerpos nativos se pueden generar mediante semisíntesis o síntesis.

Existen dos índices principales para evaluar la calidad de una biblioteca de anticuerpos: la capacidad de almacenamiento y la diversidad. Una gran capacidad de almacenamiento, combinada con una alta diversidad, garantiza la selección eficaz de anticuerpos con alta afinidad y especificidad.

En el proceso de elutriación biológica, la biblioteca de fagos se incuba con dianas fijas y se lava exhaustivamente para eliminar los fagos no reactivos. Los conjugados se eluyen típicamente con una solución ácida o de alta concentración salina y, posteriormente, se amplifican en células huésped adecuadas para su enriquecimiento. Tras 3 a 5 rondas de cribado, se obtienen anticuerpos de alta afinidad.

Los métodos de cribado de fagos incluyen principalmente el cribado en fase sólida, el cribado en fase líquida y el cribado basado en células. La selección del método de cribado adecuado debe tener en cuenta las características de las moléculas objetivo, los objetivos del proceso de cribado y el entorno del laboratorio.

La selección positiva es el método fundamental para detectar anticuerpos de fagos que se unen a proteínas diana. La selección negativa sirve para eliminar anticuerpos inespecíficos. Durante el proceso de selección de anticuerpos de fagos, pueden identificarse anticuerpos inespecíficos debido a la interferencia del marcador del antígeno diana, otros materiales u otros antígenos con estructuras similares. En estos casos, la selección negativa puede mejorar la eficacia del proceso.

Los métodos para la verificación de anticuerpos suelen incluir ELISA, Western Blot (WB), citometría de flujo, inmunoprecipitación (IP), inmunofluorescencia (IF), inmunohistoquímica y diversas técnicas experimentales. Alpha Lifetech cuenta con una amplia experiencia en la detección de anticuerpos y un equipo experimental profesional que garantiza la eficacia de los anticuerpos en experimentos posteriores.