En 1960 se propuso el concepto de anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos, también conocidos como anticuerpos monoclonales biespecíficos, son anticuerpos sintetizados artificialmente mediante ingeniería genética. Como anticuerpos artificiales diseñados, los anticuerpos biespecíficos suelen pertenecer a la subclase IgG y contienen un fragmento de unión al antígeno dirigido a la subunidad CD3. Los anticuerpos biespecíficos poseen dos sitios de unión específicos que pueden unirse y reconocer simultáneamente dos antígenos diferentes, o dos epítopos diferentes de un antígeno. En comparación con los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos biespecíficos tienen un sitio de unión específico adicional, lo que les confiere una mayor especificidad y capacidad de focalización, permitiendo atacar con mayor precisión las células tumorales y reducir la toxicidad fuera de objetivo. Los anticuerpos biespecíficos pueden realizar simultáneamente múltiples funciones biológicas, como reclutar células inmunitarias, bloquear vías de señalización y eliminar directamente las células tumorales. Los primeros anticuerpos biespecíficos se preparaban principalmente mediante conjugación química o fusión celular, pero este método pudo haber progresado lentamente debido a la combinación aleatoria y la dificultad para aislar la combinación objetivo. Con el continuo desarrollo de la tecnología de ingeniería genética, se han desarrollado muchas plataformas tecnológicas nuevas, como nudos en agujeros (KIH), CrossMab, DVD Ig, etc. Estas plataformas resuelven eficazmente problemas como los desajustes entre cadenas pesadas y ligeras, y mejoran la uniformidad y el rendimiento de los anticuerpos biespecíficos.

Los principales métodos para la producción de anticuerpos biespecíficos incluyen el acoplamiento químico, el hibridoma de cuatro fuentes y la preparación de anticuerpos mediante ingeniería genética. Entre ellos, el método de acoplamiento químico une dos IgG intactas o dos fragmentos de anticuerpos F(ab')₂ para formar anticuerpos biespecíficos utilizando agentes de acoplamiento químico como ftalimida y ácido ditioacilbenceno. Este método es simple y fácil de operar, pero puede dañar el sitio de unión del antígeno, reducir la actividad del anticuerpo y el propio agente de acoplamiento tiene cierto grado de carcinogenicidad. El método del hibridoma de cuatro fuentes se basa en la fusión de células somáticas de dos líneas celulares de hibridoma diferentes para expresar la IgG de ratón correspondiente. Mediante la tecnología de ingeniería genética, los anticuerpos pueden modificarse genéticamente para formar anticuerpos biespecíficos. Se construyeron dos anticuerpos monoclonales diferentes y se escindieron por separado los fragmentos Fab o las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de ambos anticuerpos. Mediante una reacción de reticulación o tecnología de recombinación de cadenas, los dos fragmentos se combinaron para formar un anticuerpo biespecífico. Aunque la ingeniería genética presenta una complejidad relativamente alta, actualmente es el método más utilizado para la producción de anticuerpos biespecíficos, permitiendo ajustar su estructura y función. Al diseñar anticuerpos biespecíficos, se puede recurrir al principio de reactividad cruzada, pero esta puede provocar reacciones inespecíficas, por lo que debe considerarse cuidadosamente en la aplicación práctica del diseño de anticuerpos biespecíficos, como en la terapia con anticuerpos biespecíficos.

La purificación de anticuerpos biespecíficos es el proceso de aislar y purificar anticuerpos diana de alta pureza. Se utilizan dos métodos, la centrifugación y la filtración profunda, para eliminar algunas impurezas solubles. El anticuerpo biespecífico diana se captura inicialmente mediante cromatografía de afinidad. Para anticuerpos biespecíficos tipo IgG, se utiliza cromatografía de afinidad con proteína A, mientras que para anticuerpos biespecíficos que no son tipo IgG, se puede utilizar cromatografía de afinidad basada en cadenas ligeras. Posteriormente, el anticuerpo se incuba en condiciones de pH bajo durante un cierto período de tiempo, lo que provoca la ruptura de la estructura proteica en la superficie de la envoltura viral, perdiendo así la capacidad de infectar células. Se realiza una filtración profunda intermedia para eliminar aún más impurezas, como las proteínas de la célula huésped (HCP). La pureza de los anticuerpos se mejora mediante métodos como la cromatografía de intercambio iónico, y cualquier virus residual se elimina mediante técnicas de nanofiltración o ultrafiltración. Finalmente, la muestra se concentra y se reemplaza con un tampón de formulación adecuado.