Servicio de análisis de interacciones proteína-proteína
Alpha Lifetech también puede proporcionar a sus clientes ensayos de proteínas, análisis de interacción de proteínas, ensayos de interacción proteína-proteína (CO-IP, Western Blot, ensayo de inmunoprecipitación de cromatina) y ensayos de función de proteínas para satisfacer las necesidades experimentales de diferentes clientes.
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Servicio de análisis de interacciones proteína-proteína
Alpha Lifetech lleva muchos años dedicada a los ensayos de proteínas, ha desarrollado una sólida plataforma para el análisis de la función proteica y domina diversos métodos técnicos para verificar la interacción de las proteínas, lo que permite ahorrar tiempo en la investigación científica o en proyectos de investigación, a la vez que ofrece resultados estables.
Alpha Lifetech también puede proporcionar a sus clientes ensayos de proteínas, análisis de interacción de proteínas, ensayos de interacción proteína-proteína (CO-IP, Western Blot, ensayo de inmunoprecipitación de cromatina) y ensayos de función de proteínas para satisfacer las necesidades experimentales de diferentes clientes.
Introducción al ensayo de interacción proteína-proteína
Las proteínas son las moléculas ejecutivas más importantes en cualquier forma de vida, ya que responden a las instrucciones almacenadas en el material genético. Con frecuencia, las proteínas desempeñan sus funciones interactuando con otras proteínas, lo cual se hace más evidente al examinar su función en el contexto celular. Identificar las interacciones entre proteínas es fundamental para la investigación bioquímica de una proteína en particular. A continuación, se presentan algunos ejemplos de análisis de interacción proteica:
Ensayo de co-inmunoprecipitación
El principio del método de co-inmunoprecipitación consiste en mezclar la proteína diana, el anticuerpo específico y las perlas magnéticas de proteína A/G para su incubación. El sobrenadante de la proteína no unida se descarta mediante la adsorción de las perlas magnéticas en el soporte magnético, y las perlas magnéticas se lavan para eliminar la proteína y otras impurezas, a menos que estén unidas específicamente.
Figura 1. Diagrama esquemático de los ensayos de co-inmunoprecipitación (Co-IP).(Fuente de referencia: Ensayo de co-inmunoprecipitación - PubMed (nih.gov))
Ensayo de precipitación
El ensayo de precipitación consiste en fijar la proteína conocida a la microesfera magnética y añadir la sustancia que se desea detectar. El eluyente se analiza para detectar la adsorción de las proteínas que interactúan.
En 1988, Smith et al. purificaron la proteína de fusión GST, que se aplicó en ensayos de pull-down y se denomina Gst pull down, que consiste en añadir una etiqueta GST a la proteína objetivo, capturar la proteína interactuante a través de GSH, eluir la unión y verificarla mediante ensayos WB.
Figura 2. Diagrama esquemático de los ensayos de precipitación con GST.(Fuente de referencia: Ensayo de precipitación con GST para estudiar la unión de PIF4 in vitro - PubMed (nih.gov) )
Su método de purificación consiste en utilizar iones metálicos como el níquel o el cobalto como medio, purificar la proteína mediante cromatografía de afinidad y eluir la unión mediante un experimento de Western blot para su verificación.
Además, existen ensayos de precipitación de ADN (ensayo de unión de proteínas al ADN), ensayos de precipitación de ARN (ensayo de interacción de proteínas con ARN) y ensayos de precipitación de moléculas pequeñas.
El ensayo de unión de proteínas al ADN (DNA Pull-down) es un método in vitro para determinar la unión de proteínas al ADN. Mediante ensayos de Western blot (WB) se detecta si proteínas específicas se unen al ADN diana; la detección de fragmentos de ADN desconocidos unidos a proteínas se realiza mediante espectrometría de masas (MS).
El ensayo de interacción proteína-ARN (RNA Pull-down) es un método in vitro para determinar la unión del ARN a las proteínas. Mediante ensayos de Western blot (WB) se detecta si proteínas específicas se unen al ARN diana; la unión de fragmentos de ARN desconocidos a proteínas se identifica mediante espectrometría de masas (MS).
Los ensayos de precipitación con moléculas pequeñas (SM pull-down) permiten encontrar proteínas objetivo que se unen específicamente a moléculas pequeñas, y cuando se combinan con la espectrometría de masas (MS), las proteínas objetivo de moléculas pequeñas pueden ser analizadas con precisión. Este método se puede dividir en el método de marcaje in vitro y el método biológico ortogonal.
Experimento WB
El experimento WB (también conocido como Western Blot) se basa en la reacción específica entre antígeno y anticuerpo. Su principio fundamental consiste en separar las proteínas desnaturalizadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y transferirlas a un soporte de fase sólida (como una membrana de PVDF o NC) mediante transferencia por membrana (en húmedo o semiseco). Tras el bloqueo (con BSA, suero de leche, etc.), se aplica el anticuerpo primario para que se una específicamente a la proteína, y después de lavar la membrana, se añade el anticuerpo secundario marcado con fluoresceína. Al unirse el anticuerpo secundario al primario, la proteína diana se puede observar mediante el desarrollo del color del sustrato y la quimioluminiscencia. Generalmente se utiliza para determinar si una proteína específica se expresa en la muestra y para analizar de forma aproximada su nivel de expresión.
Comparación de métodos de interacción proteína-proteína
Los ensayos de pull-down de proteínas son similares a los ensayos de co-inmunoprecipitación (Co-IP), ambos pertenecientes a experimentos de detección de interacciones proteicas. La diferencia entre ambos métodos radica en que los ensayos Co-IP obtienen las proteínas que interactúan con proteínas conocidas, lo que les confiere cierta autenticidad, pero no permite confirmar si la interacción es directa o indirecta. Los ensayos de pull-down buscan la interacción de una proteína desconocida con una proteína conocida. Permiten confirmar directamente si la proteína conocida interactúa con la proteína detectada, pero no permiten determinar la situación de unión in vivo.
La tecnología de co-inmunoprecipitación se utiliza para analizar si existe una interacción entre dos o más proteínas, basándose en experimentos de inmunoprecipitación. En comparación con otras técnicas experimentales de análisis de interacción de proteínas (GST Pull-down, Western Blot, ensayo de inmunoprecipitación de cromatina, etc.), la tecnología Co-IP tiene mayor especificidad, sensibilidad y alta repetibilidad, lo que puede evitar la interferencia de la unión no específica y reflejar la interacción de las proteínas en su estado natural.
| GST (GST) desplegable | Co-IP | WB | |
|---|---|---|---|
| Ventaja | *Fácil de usar *Adecuado para la purificación de diversas proteínas | *Para análisis de interacción in vivo *Se puede identificar con la proteína posterior | *Alta especificidad *Cualitativo y cuantitativo in vitro |
| Limitación | *Posiblemente se trate de una unión no específica. *Se requiere una validación adicional de la interacción. | *Fuerte dependencia de los anticuerpos *Puede producirse una unión inespecífica. | *Pérdida de tiempo *Difícil de usar para análisis de proteínas a gran escala |
| Ejemplo de aplicación | *Identificar interacciones *Complejo proteico purificado | *Estudio de la transducción de señales *Mecanismo de la enfermedad | Análisis posterior de las interacciones proteína-proteína, proteína-ADN y proteína-ARN. |
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16/07/2018 
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