Legamiaren Gainazaleko Pantaila Liburutegiaren Bahetze Zerbitzua

Alpha Lifetech legamiaren bistaratze liburutegien eraikuntzan eta antigorputz liburutegien baheketan espezializatuta dago, legamia liburutegi mota desberdinak sortzeko eta afinitate handiko eta antigorputz espezifikoak lortzeko bahetzeko gaitasuna eskainiz mundu osoko bezeroentzat. Ikerlari adituen talde batekin, teknologia eta ekipamendu aurreratuarekin, gaixotasunekin lotutako proteina sorta zabal bati zuzendutako legamia liburutegiak eraiki ditzakegu. Fagoak bistaratzeko eta legamiaren bistaratze teknologiak eskain ditzakegu, besteak beste, proteina legamiaren bistaratzea, molekula txikiko legamiaren bistaratzea, antigorputzen legamiaren bistaratzea, etab.

Gure legamiaren bistaratze liburutegiek ahalmen eta dibertsitate handia dute, eta horrek oinarri sendoa eskaintzen du antigorputz-sekuentzia espezifikoen baheketa eraginkorrerako. Zure beharren arabera, antigorputz-legamien bistaratze liburutegi mota desberdinak (IgG, scFv, VHH, Fab antigorputz-liburutegiak), proteina-liburutegiak, peptido-liburutegiak, cDNA-liburutegiak, etab. eraiki ditzakegu. Horrez gain, propietate desberdinetako antigorputz-liburutegiak ere garatu ditzakegu, besteak beste, sistema immunologikoko liburutegiak, liburutegi naturalak, liburutegi sintetikoak, liburutegi erdi-sintetikoak eta gaixotasunen aurkako antigorputz-liburutegiak.

Legamiaren Pantaila Sistemaren Sarrera

Legamiaren gainazaleko bistaratze teknologia legamiaren gainazalean proteina birkonbinatuak geneen fusioaren bidez bistaratzeko metodo bat da. Legamiaren bistaratze sistema ohikoenak alfa lektina parekatze proteinaren Aga2p azpiunitatearen C-muturrari fusionatutako proteina erabiltzen du, batez ere helburu proteinaren bi aldeetako epitopo etiketek osatua: N-muturreko 9 aminoazido hemaglutinina (HA) etiketa eta C-muturreko 10 aminoazido c-myc etiketa. 69 aminoazidoko Aga2p azpiunitatea 725 aminoazidoko alfa lektina Aga1p azpiunitatearekin lotzen da bi disulfuro loturaren bidez, eta Aga1p zelula horman ainguratuta dago β 1,6-glukano lotura kobalente baten bidez. Beraz, helburu proteina legamia zelulen gainazalean bistaratzen da eta ondoren dagokion ligandoak ezagutzen du. Proteina funtzionalak liburutegietatik bereizi fluxu zitometria baheketaren bidez.

1. irudia: Legamiaren gainazalaren bistaratzeko printzipioa. (Irudiaren iturria: Legamiaren gainazaleko bistaratzearen aplikazioak proteinen ingeniaritzan.)

Legamiaren gainazaleko bistaratze liburutegiaren sarrera

Legamiaren gainazaleko pantailaren sailkapena legamiaren gainazaleko pantailan oinarritzen da, batez ere zelula-gainazaleko proteinei zuzendutako antigorputz-liburutegiak aztertzeko erabiltzen dena. Legamiaren zelulen eta beste zelula-gainazalen arteko lotura ez-espezifiko txikia dela eta, legamiaren hautaketa biologikoak lotura-liburutegi handiak azter ditzake klon arraroak aurkitzeko.

Legamiaren Gainazaleko Pantaila Liburutegiaren Bahetze Zerbitzua

Prestatu plasmidoak eta landu legamia-zelulak, sintetizatu proteina kodetzen duen DNA eta klonatu legamia-adierazpen bektore batean, sustatzaile induzigarriak, seinale-peptidoak eta gainazaleko bistaratze-proteinei (Aga2p bezalakoei) fusionatutako geneak dituena. Proteina kodetzen duen genea legamia-zelula-hormako proteina kodetzen duen genearekin (normalean Aga2p) fusionatu daiteke, eta fusionatutako genea legamia-zeluletan eraldatu daiteke elektroporazioaren bidez. Eraldaketaren ondoren, gainazalean antigorputz-geneak adierazten dituzten legamia-zelulek antigeno-espezifikoen bahetze-probak jasan ditzakete: legamia-liburutegia antigeno-xehearekin inkubatzen da eta berarekin espezifikoki lotzen diren legamia-zelulak hautatzen dira. Fluoreszentzia aktibatutako zelulen sailkapena (FACS) erabiliz, nahi diren ezaugarriak dituzten proteinak erakusten dituzten legamia-zelulak isolatzeko, legamia-bistaratze liburutegiaren bahetzea egin daiteke ~10 ^ 8-10 ^ 9 legamia-zelulen gehienezko liburutegi-tamainarekin. Klon positiboak isolatu daitezke analisi gehiago egiteko edo ondorengo aplikazioetarako. Behin antigorputz-liburutegitik antigorputz-klon espezifikoak identifikatu ondoren, gehiago karakterizatu eta masa-ekoiztu daitezke, eta proteina A/G afinitate-kromatografia bezalako teknikak erabiliz purifikatu, legamia-bistaratze-bahetze eta antigorputzen ekoizpen prozesu osoa osatzeko.

Legamia-Bistaratzeko Liburutegiaren Baheketa Prozesua

2. irudia Legamiaren bistaratze liburutegiaren bahetze prozesua

Legamiaren Pantaila Liburutegiaren Bahetze Zerbitzuaren Lan-fluxua

Urratsak	Zerbitzuaren edukia	Denbora-lerroa
Antigenoen prestaketa	Antigeno mota: Bezeroak antigenoak eman baditzake, dagokien laginak motaren arabera entregatu behar dira: proteina birkonbinatuek 3-3,5 mg behar dituzte % 85etik gorako purutasun-eskakizunarekin, molekula txikiek % 90etik gorako purutasun-eskakizunarekin konjugatu behar dute, peptidoen sintesia % 90etik gorako purutasun-eskakizunarekin konjugatu behar da, birusak bezalako lagin motak inaktibatu behar dira, RNA ikuskatu behar da degradazioa saihesteko, eta goiko antigeno motak ere pertsonaliza daitezke sintesirako.	2-3 aste
Animalien immunitatea	Animalien txerto kopurua 5 da, eta txerto kopurua handitu behar den ala ez zehaztu behar da serumaren tituluen proban oinarrituta. Antigenoen immunitatea: proteina/birus antigenoen potentzia>105; peptidoen/molekula txikien antigenoen potentzia>10^4	5-6 aste
Txantiloi ADNcaren prestaketa	Banandu plasmako PBMCak, erauzi RNA osoa (RNA erauzketa kita) eta alderantzikatu cDNAra.	Egun 1
Liburutegiaren eraikuntza	Liburutegiko ADNk txantiloi gisa erabiliz, VHH genea bi PCR txandatan anplifikatu zen, eta VHH genearen splicing legamia bistaratze bektorea eraiki zen. Bektorea legamia-zeluletan eraldatu zen elektroporazio bidez antigorputz liburutegi bat eraikitzeko. Ausaz hautatu 48 klon eta identifikatu tasa positiboa (% 90) PCR metodoa erabiliz; kalkulatu liburutegiaren edukiera (10^7-10^8), NGS sekuentziazioa liburutegiaren txertatze-tasa zuzena (% 90) eta liburutegiaren dibertsitatea zehazteko.	2 aste
Liburutegiko emanaldia	Hiru txanda lehenetsiak: fluoreszentziaz markatutako proteina FACS baheketa, eta ondoren NGS sekuentziazioa hirugarren txandan. Klon positiboak hautatu ziren gramo bakarreko indukzio-adierazpenerako eta ELISA detekziorako. Klon positibo guztiak hautatu ziren geneen sekuentziaziorako, eta CDR eskualdeko sekuentzia desberdinak hautatu ziren.	2-3 aste
Antigorputzen egiaztapena	Antigorputzen sekuentzietarako adierazpen bektore egokiak eraikitzeak antigorputzen adierazpena, antigorputzen purifikazioa, antigorputzen antigenoen loturaren ELISA eta BLI balidazioa erraztu dezake antigorputzen afinitatea egiaztatzeko, eta fluxu zitometria blokeatzea zelulen funtzioa balioztatzeko.	Astebete

Legamiaren gainazaleko bistaratze liburutegiaren baheketaren kasua

Legamiaren gainazaleko bistaratze plataformaren literaturan, nanogorputz konformazionalki selektiboen aurkikuntza azkarra egiteko, egileek in vitro nanogorputzen aurkikuntza plataforma oso bat ezarri zuten legamiaren gainazaleko bistaratzean oinarrituta. Lehenik eta behin, nanogorputz sintetikoen liburutegi bat diseinatu zen gamelu-genetatik abiatuta. D irudiak erakusten du nanogorputzak HA etiketa bat duela karboxilo muturrean, eta gero nanogorputza kobalenteki finkatzen dela legamiaren zelula-horman. E irudiak nanogorputzen bahetze-prozesua erakusten du. Antigenoarekiko afinitatea zuten legamiak isolatu, anplifikatu eta behin eta berriz hautatu ziren antigorputzen bila FACS bidez. Egileek bi giza GPCR desberdin helburu dituzten nanogorputz konformazionalki selektiboak aurkitu zituzten plataforma honen bidez.