پلتفرم اندازه‌گیری میل ترکیبی

آلفا لایف‌تک، بر اساس پلتفرم Octet و Biacore-T2000، می‌تواند خدمات تعیین تمایل قابل اعتمادی ارائه دهد. ما می‌توانیم تعیین تمایل را برای نمونه‌های متعدد، مانند آنتی‌بادی‌ها، سلول‌ها، پروتئین‌ها، مولکول‌های کوچک و غیره ارائه دهیم. روش‌های مختلفی برای تعیین تمایل وجود دارد، از جمله تعیین تمایل با رزونانس پلاسمون سطحی (SPR) و تداخل لایه زیستی (BLI).

آلفا لایف‌تک دارای یک پلتفرم تعیین تمایل حرفه‌ای و دقیق است که ELISA را با تعیین تمایل ترکیب می‌کند و نتایج تعیین تمایل حرفه‌ای، کارآمد، سریع و دقیقی را برای مشتریان در سراسر جهان ارائه می‌دهد. ما می‌توانیم دو روش برای انتخاب مشتریان ارائه دهیم: تعیین تمایل سریع و تعیین تمایل دقیق. تعیین تمایل سریع، تعیین تک غلظت است، در حالی که تعیین تمایل دقیق می‌تواند تمایل غلظت‌های مختلف را اندازه‌گیری کند. برای مطالعه برهمکنش‌های بین ترکیبات مختلف مولکول‌های کوچک، پپتیدها، پروتئین‌ها، الیگونوکلئوتیدها و الیگومرها و همچنین لیپیدها، باکتریوفاژها، ویروس‌ها و سلول‌ها کاربرد دارد. پلتفرم اندازه‌گیری تمایل می‌تواند پایه و اساسی برای آزمایش و غربالگری داروهای تمایلی، کشف آنتی‌بادی و تسهیل تحقیقات بعدی باشد.

مقدمه‌ای بر میل پیوند

میل ترکیبی در ارزیابی برهمکنش‌های بین مولکولی، سنجش‌های دارویی میل ترکیبی و غربالگری دارو اهمیت دارد. برهمکنش‌های بین مولکولی را می‌توان با معادلات زیر توصیف کرد: L + R = LR، که در آن L نشان دهنده لیگاندهای آزاد، R نشان دهنده گیرنده‌های غیر متصل و LR نشان دهنده کمپلکس‌های لیگاند-گیرنده متصل است. واکنش‌های اتصال، برهمکنش‌های بین مولکولی را تعریف می‌کنند، که در آن تبادل پویا بین حالت‌های متصل و غیر متصل در طول واکنش تا رسیدن به تعادل رخ می‌دهد. این را می‌توان با دو ثابت سرعت، Kon (ثابت سرعت اتصال) و Koff (ثابت سرعت تفکیک) واکنش توصیف کرد. مقدار Kd، که معکوس ثابت اتصال (Ka) است، Koff/Kon است که یک ثابت مهم برای میل ترکیبی واکنش است. بنابراین، هرچه اتصال بین دو مولکول محکم‌تر باشد، میل ترکیبی بیشتر است. هرچه مقدار Kd کوچکتر باشد، برعکس. این معادله را می‌توان به صورت یک منحنی S شکل روی یک نمودار نیمه لگاریتمی نشان داد، که غلظت لیگاند روی محور x (روی محور مقیاس لگاریتمی) و مرز کسری روی محور y قرار دارد. خط چین نشان دهنده غلظت لیگاند در Kd (1 nM) با کسر اتصال 0.5 است.

شکل 1: منحنی اتصال سیگموئیدی غلظت‌های مختلف لیگاند متصل به گیرنده سطح سلول. (منبع مرجع: هانتر اس. ای.، کاکران جی. آر. سنجش‌های اتصال سلولی برای تعیین میل ترکیبی تعاملات پروتئین-پروتئین: فناوری‌ها و ملاحظات.)

روش‌های تعیین میل ترکیبی

سنجش تمایل اتصال ELISA

تکنیک پرکاربرد برای مطالعه‌ی میل ترکیبی آنتی‌بادی، مبتنی بر روش ELISA است که با راحتی، سرعت، سادگی، حساسیت بالا و اختصاصیت قوی مشخص می‌شود. این روش می‌تواند از مقدار کمی معرف (یعنی آنتی‌بادی‌ها و آنتی‌ژن‌ها) استفاده کند و میل ترکیبی آنتی‌بادی را بدون نیاز به معرف‌های خالص‌سازی اندازه‌گیری کند. با تثبیت آنتی‌ژن روی یک سطح جامد و تشخیص آن با استفاده از یک آنتی‌بادی اولیه، آنتی‌بادی ثانویه نشاندار شده با آنتی‌بادی اولیه واکنش می‌دهد تا داده‌ها را در یک دستگاه خوانشگر سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) بخواند و تجزیه و تحلیل کند.

شکل ۲: سنجش‌های شبه الایزا برای ارزیابی اتصال پپتیدهای طراحی‌شده به اهدافشان. (منبع مرجع: حاجی‌کریملو، مریم و همکاران، 2022. یک رویکرد محاسباتی برای طراحی سریع پپتیدهایی که پروتئین سطحی S ویروس SARS-CoV-2 را شناسایی می‌کنند.)

سنجش تمایل اتصال رزونانس پلاسمون سطحی (SPR)

فناوری SPR عمدتاً تغییرات در ضریب شکست را تشخیص می‌دهد. با کمک پدیده‌های نوری سنتی و پدیده رزونانس نور، می‌توان یک فناوری تجزیه و تحلیل حسگر زیستی برای برهمکنش بین مولکول‌های زیستی ساخت تا برهمکنش بین لیگاندها و آنالیت‌ها را روی تراشه‌های حسگر زیستی تشخیص دهد. سیگنال‌های خاص اتصال و برهمکنش بین مولکول‌های زیستی را می‌توان با نظارت بر تغییرات پویا در زوایای SPR در طول واکنش‌های بیولوژیکی به دست آورد.

شکل ۳: تحلیل رزونانس پلاسمون سطحی (SPR) از اتصال H10/AGR2. (منبع مرجع: گری، کارولینا و همکاران، 2018. شناسایی، توصیف و کاربرد یک پپتید جدید علیه همولوگ گرادیان قدامی 2 (AGR2).)

سنجش تمایل اتصال تداخل لایه زیستی (BLI)

فناوری تداخل بیوفیلم یک تکنیک تشخیص نوری بدون برچسب و پایش بلادرنگ است که عمدتاً برای تجزیه و تحلیل کمی جامع از برهمکنش‌های بین مولکولی و تعیین غلظت پروتئین استفاده می‌شود. این فناوری از یک حسگر زیستی مبتنی بر پروب برای تشخیص مستقیم تغییرات در ضخامت بیوفیلم روی نمونه استفاده می‌کند. با تشخیص تغییرات جابجایی طیف تداخل، اتصال و تفکیک بین مولکول‌های زیستی که روی سطح حسگر تعامل دارند، شناسایی می‌شود و جابجایی بلادرنگ (نانومتر) طیف تداخل نمایش داده می‌شود.

شکل 4: سنجش تداخل‌سنجی لایه زیستی (BLI) بین aLDRG و کیتینولیگوساکاریدها. (منبع مرجع: لی، بینگ، 2023. نشانه‌های مقایسه‌ای رونوشت بین ریزومورف‌ها و هیف‌های گونه Armillaria sp. 541 که در همزیستی قارچی با تأکید بر دامنه‌های LysM شرکت می‌کنند.)

مقایسه فناوری BLI و SPR

نام فناوری	تداخل‌سنجی لایه‌های زیستی (BLI)	SPR (رزونانس پلاسمون سطحی)
اصل	تغییرات الگوی تداخل نور منعکس شده روی سطح حسگر را اندازه‌گیری می‌کند و برهمکنش‌های مولکولی را از طریق تغییرات ضخامت نوری روی لایه زیستی تشخیص می‌دهد. این دستگاه یک منحنی اتصال در زمان واقعی (اندازه‌گیری مستقیم) ارائه می‌دهد.	با تشخیص تغییرات سیگنال در ضریب شکست در نزدیکی سطح تراشه حسگر، برهمکنش‌های مولکولی را اندازه‌گیری می‌کند (زمانی رخ می‌دهد که نور با فصل مشترک طلا و شیشه برهمکنش می‌کند و باعث تغییر در ضریب شکست می‌شود). داده‌ها به صورت تغییرات در زاویه رزونانس (اندازه‌گیری غیرمستقیم) منعکس می‌شوند.
تولیدکننده	سارتوریوس	جنرال الکتریک
ساز	حسگرهای زیستی ForteBio	ابزار SPR را باز کنید
سیستم	سیستم هشت‌تایی ForteBio (برای تجزیه و تحلیل برهمکنش‌های مولکولی)	TraceDrawer (توسعه یافته توسط Ridgeview Instruments، سوئد)
مزایا	۱. سازگاری گسترده با نمونه، پایداری عالی، به ویژه برای تشخیص مولکول‌های کوچک (الزامات خاص برای خلوص نمونه و شرایط بافر کمتر سختگیرانه است). تراشه‌های SSA برای مطالعات اتصال مقرون به صرفه هستند. ۲. توان عملیاتی سریع‌تر و زمان آزمایش کوتاه‌تر در مقایسه با SPR.	۱. سابقه توسعه طولانی‌تر، که حساسیت بالاتری را در مقایسه با BLI ارائه می‌دهد. ۲. دقت و استحکام بیشتر برای کاربردهای خاص، مانند تشخیص پروتئین‌های نادر یا ارزشمند با داده‌های میل ترکیبی و اختصاصیت بالاتر.
معایب	۱. دقت داده‌ها در مقایسه با SPR کمی پایین‌تر است. ۲. نیاز به نگهداری دقیق از دستگاه دارد. ۳. هزینه تراشه SSA نسبتاً بالاست.	۱. شرایط بافر برای تشخیص مولکول‌های بسیار کوچک می‌تواند دشوار باشد و خطر شکست در تشخیص را افزایش می‌دهد. ۲. تراشه‌ها معمولاً گران‌تر از تراشه‌های مورد استفاده در BLI هستند. ۳. تبخیر نمونه در طول آزمایش‌های طولانی می‌تواند یک مشکل باشد.
نوع تراشه	تراشه SSA	تراشه NTA

دامنه اندازه‌گیری میل ترکیبی

تعیین میل ترکیبی می‌تواند شامل آنتی‌ژن-آنتی‌بادی (آنتی‌ژن-آنتی‌بادی قوی، آنتی‌ژن-آنتی‌بادی ضعیف)، پروتئین-پروتئین، پروتئین-پپتید، پروتئین-مولکول کوچک و DNA/RNA پروتئین (آپتامر) باشد. هنگام اندازه‌گیری KD، لازم است یکی از غلظت‌های مولی را بدانیم. وقتی مولکول‌های کوچک متصل می‌شوند، وزن مولکولی یک مولکول نمی‌تواند کمتر از ۱۵۰ دالتون باشد.

نوع	محدوده	موارد احتیاط
۱. آنتی‌ژن-آنتی‌بادی	۱۰^-۶ تا ۱۰^-۱۲	مقادیر Kd اکثر آنتی‌بادی‌ها در محدوده 10^-6-10^-7 تا 10^-9 است. به طور کلی اعتقاد بر این است که آنتی‌بادی‌های با میل ترکیبی بالا در محدوده 10^-9 هستند، در حالی که آنتی‌بادی‌های با میل ترکیبی بالا در محدوده 10^-12 قرار دارند.
۲. پروتئین - مولکول‌های کوچک	۱۰^-۴ تا ۱۰^-۵	KD مولکول‌های کوچک و پروتئین‌ها بین 10^-4 و 10^-5 است، در حالی که 10^-3 و 10^-7 طبیعی هستند و نمی‌توانند به 10^-10 برسند. مولکول‌های کوچک کووالانسی ممکن است به 10^-10 برسند.
۳. آویدین-بیوتین	۱۰^-۱۴	افینیتی به راحتی می‌تواند تحت اتصال غیر اختصاصی قرار گیرد و می‌توان از استرپتاویدین یا افینیتی دگلیکوزیله استفاده کرد.
۴. پروتئین DNA	۱۰^-۸ تا ۱۰^-۱۰	DNA با کیفیت بالا و کامل؛ مراقب باشید که از تأثیر الکتروفورز جلوگیری شود.

الزامات نمونه برای تعیین میل ترکیبی

نمونه	الزامات
۱. نمونه مولکول بزرگ	پروتئین > 50 میکروگرم، آنتی‌بادی > 100 میکروگرم، پروتئین بیوتینیله شده > 200 میکروگرم؛ پروتئین بدون بیوتین > 2 میلی‌گرم، نیاز به خلوص > 90٪، محلول بافر: PBS، HEPBS. نمی‌تواند حاوی گروه‌های ایمیدازول باشد؛ کنترل کیفیت لازم است.
۲. نمونه مولکول کوچک	مقدار > 1 میلی‌گرم، پودر یا مایع، مایع باید در آب یا DMSO محلول باشد. سعی کنید حاوی گلیسرول، ایمیدازول، ترهالوز یا سایر نمک‌ها نباشد؛ سعی کنید از معرف‌هایی با گروه‌های آمینه مانند Tris در بافر، به طور کلی PBS، HEPPS و غیره بدون معرف‌های آلی، خودداری کنید.

مزایای پلتفرم اندازه‌گیری میل ترکیبی

تحلیل چند نمونه‌ای

آلفا لایف‌تک می‌تواند سنجش‌های میل ترکیبی را برای نمونه‌های مختلف، از جمله آنتی‌بادی‌ها، سلول‌ها، پروتئین‌ها و سایر مولکول‌های زیستی ارائه دهد.

پلتفرم فناوری بالغ

ما فناوری‌های پیشرفته‌ای مانند سنجش اتصال spr، سنجش اتصال bli و سنجش اتصال elisa داریم.

انتخاب پروژه انعطاف‌پذیر

مشتریان می‌توانند بین تعیین سریع وابستگی و تعیین دقیق وابستگی یکی را انتخاب کنند.

نتایج با دقت بالا

تیم فنی حرفه‌ای ما می‌تواند نتایج تعیین وابستگی کارآمد، دقیق و قابل اعتماد را تضمین کند.

مطالعه موردیمورد

سنجش سریع میل ترکیبی BLI، آنتی‌بادی و سنجش میل ترکیبی آپتامر

آپتامرهای بیوتینیله شده را با ویژگی پروب SA گرفته و حل کنید. نمونه را حل کرده و تا غلظت ثابت رقیق کنید، آپتامرهای Target 1-5 گرفته شده مخصوص پروب را جامد کنید و پس از اشباع سیگنال، به نمونه متصل شوید. سپس آنها را به یک پلیت ۹۶ خانه‌ای اضافه کنید.

شکل ۵: توزیع موقعیت‌های تشخیص برای نمونه‌های پلیت ۹۶ چاهکی. B به بافری اشاره دارد که برای متعادل‌سازی و تفکیک حسگرها استفاده می‌شود. L: آپتامرهای Biotin Target 1-5، ۲۲۱: نمونه.

برای اطمینان از پایداری و دقت داده‌ها، به حفاری توجه کنید و برنامه مربوطه را برای به دست آوردن نتایج تنظیم کنید:

شکل 6: نمودار برازش برهمکنش بین آپتامرهای Target 1، 2 و 3 و نمونه‌ها. (CH 1 \ 3 \ 5 نشان دهنده سیگنال و داده‌های برهمکنش بین پروب آپتامرهای جامد شده Target 1 \ 2 \ 3 و نمونه است.)

شکل 7: نمودار برازش برهمکنش بین آپتامرهای Target 4 و 5 و نمونه‌ها. (CH 1 \ 3 نشان دهنده سیگنال و داده‌های برهمکنش بین پروب آپتامر جامد شده Target 4 \ 5 و نمونه است.)

نتایج نشان می‌دهد

نتایج زیر به دست آمد: میزان چسبندگی آداپتور تارگت ۱ به نمونه پس از برازش ۹.۴۱ ^ -۸؛ میزان چسبندگی آداپتور تارگت ۲ به نمونه پس از برازش ۸.۳۲ ^ -۸؛ میزان چسبندگی آداپتور تارگت ۳ به نمونه پس از برازش ۸.۶۴ ^ -۸؛ میزان چسبندگی آداپتور تارگت ۴ به نمونه پس از برازش ۳.۷۰ ^ -۸؛ میزان چسبندگی آداپتور تارگت ۵ به نمونه پس از برازش ۳.۰۱ ^ -۸ بود.

اگر سوالی دارید، لطفا در هر زمانی با ما تماس بگیرید.

Leave Your Message

خدمات ویژه

0102