سرویس تحقیقاتی آپتامر

مقدمه ای بر آپتامر

آپتامرها مولکول‌های اسید نوکلئیک تک رشته‌ای (مانند DNA یا RNA) هستند که در شرایط آزمایشگاهی از کتابخانه‌ای از اولیگونوکلئوتیدهای مصنوعی با توالی‌هایی که به‌طور تصادفی اختصاص داده شده‌اند، توسط فرآیندی به نام غربالگری SELEX، که شامل چندین دور انتخاب تکراری است، غربالگری می‌شوند. اجزای اصلی خدمات توسعه آپتامر متعلق به Alpha Lifetech شامل ساخت کتابخانه آپتامر، غربالگری آپتامر SELEX، توالی یابی آپتامر SELEX، تجزیه و تحلیل توالی آپتامر و سایر تجزیه و تحلیل آپتامر است.

توالی‌یابی SELEX، غربالگری آپتامر SELEX و توالی‌یابی با توان بالا را ترکیب می‌کند. از طریق توالی یابی آپتامر SELEX، توالی خاص آپتامر متصل به هدف را می توان به طور موثر تعیین کرد و داده های اساسی را برای تحلیل و کاربرد بعدی توالی آپتامر فراهم می کند.

آپتامرها به طور گسترده ای در تحقیقات علمی، درمان بیماری، ساخت حسگرهای زیستی، کشف دارو و نظارت بر محیط زیست استفاده شده است. با این حال، آپتامرهای الیگونوکلئوتیدی که در شرایط آزمایشگاهی غربال شده بودند به راحتی در داخل بدن تجزیه شدند و حتی سمیت را نشان دادند. بنابراین، پس از بهینه سازی آپتامرهای غربال شده، آنالیز آزمایشگاهی برای ارزیابی موفقیت توسعه آپتامر مورد نیاز است. با توجه به نیازهای تحلیلی متفاوت مشتریان، آلفا لایف‌تک انواع استراتژی‌های تحلیل آپتامر را برای مشتریان در نظر گرفته است.

شکل 1 نمودار آنالیز آپتامر. منبع مرجع:Thevendran R، Citartan M. 2022. سنجش برای تخمین میل اتصال آپتامرها.

مقدمه ای بر سرویس تحقیقاتی آپتامر

تجزیه و تحلیل پایداری آپتامر

آزمایش تجزیه هسته

با انکوبه کردن آپتامر با انواع مختلف نوکلئازها (مانند DNase، RNase و غیره) در شرایط خاص، تخریب آپتامر مشاهده می شود تا توانایی ضد تجزیه آن ارزیابی شود. این برای تعیین پایداری و دوام آپتامر در کاربردهای عملی مفید است.

روش برچسب زدن فلورسنت

پایداری آپتامر به طور غیرمستقیم با برچسب زدن فلوروفورها روی آپتامر و مشاهده تغییرات سیگنال فلورسانس قبل و بعد از اتصال با هدف ارزیابی می شود. به عنوان مثال، هنگامی که یک آپتامر به یک هدف متصل می شود، ترکیب آن ممکن است تغییر کند و در نتیجه سیگنال فلورسانس افزایش یافته یا کاهش یابد.

تجزیه و تحلیل پایداری حرارتی

پایداری حرارتی آپتامر با اندازه گیری تغییر دمای ذوب آن (مقدار Tm) در دماهای مختلف ارزیابی می شود. هر چه دمای ذوب آپتامر بیشتر باشد، پایداری حرارتی آن بهتر است.

تجزیه و تحلیل پایداری دینامیکی

تشدید پلاسمون سطحی (SPR) و سایر فناوری‌ها برای نظارت بر فرآیند اتصال و جداسازی بین آپتامر و هدف در زمان واقعی، به دست آوردن پارامترهای دینامیکی (مانند ثابت سرعت اتصال، ثابت سرعت تفکیک و غیره)، درک بیشتر مکانیسم تعامل بین آپتامر و هدف، و ارزیابی پایداری دینامیکی آن مورد استفاده قرار گرفت.

تحلیل پایداری سازه

کریستالوگرافی اشعه ایکس، رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) و سایر تکنیک های زیست شناسی ساختاری برای تجزیه و تحلیل ساختار سه بعدی آپتامر و پایداری ساختاری آن استفاده شد.

تجزیه و تحلیل اختصاصی آپتامر

سنجش اتصال آپتامر

میل ترکیبی با انجام سنجش اتصال آپتامر برای اندازه‌گیری ثابت اتصال بین آپتامر و مولکول هدف، مانند ثابت تفکیک Kd، ارزیابی می‌شود. مقدار Kd کمتر نشان دهنده تمایل بیشتر است. سنجش اتصال آپتامر می تواند کاندیدهای دارویی را با توانایی اتصال بالا غربال کند و سپس مطالعات فارماکودینامیک و فارماکوکینتیک بعدی را انجام دهد.

آزمایش غربالگری معکوس

روش غربالگری معکوس یک روش غربالگری برای حذف سریع مولکول های غیرهدف از تعداد زیادی از مولکول های کاندید است. غربالگری معکوس برای حذف مولکول هایی طراحی شده است که این ویژگی یا عملکرد را ندارند. کلید غربالگری معکوس، انتخاب نشانگرها یا شرایط غربالگری معکوس مناسب است که امکان شناسایی و حذف مولکول های غیر هدف را در طول فرآیند غربالگری فراهم می کند. در این آزمایش، انتخاب مولکول های غیر هدف بسیار مهم است. باید اطمینان حاصل شود که مولکول های غیر هدف انتخاب شده نماینده موادی هستند که ممکن است با غربالگری آپتامر تداخل داشته باشند و عوامل تداخل احتمالی تا حد امکان به طور کامل پوشش داده شوند.

آزمایش بازداری رقابتی

با افزودن رقبای بیش از حد (مانند مولکول هایی با ساختار مشابه مولکول هدف) به سیستم اتصال آپتامر و مولکول هدف، تغییر قابلیت اتصال آپتامر و مولکول هدف مشاهده می شود. اگر توانایی آپتامر برای اتصال به مولکول هدف به طور قابل توجهی کاهش یابد، نشان دهنده این است که آپتامر دارای ویژگی بالایی است.

در برخی موارد، آزمایش‌های بازداری رقابتی را می‌توان به عنوان بخشی از آزمایش‌های غربالگری معکوس یا مکمل آن استفاده کرد. به عنوان مثال، در فرآیند غربالگری دارو، توانایی مولکول دارو برای اتصال به پروتئین هدف را می توان با آزمایش های مهار رقابتی ارزیابی کرد و سپس از آزمایش های غربالگری معکوس برای حذف آن دسته از ترکیباتی که خیلی قوی به سلول ها یا بافت های طبیعی متصل هستند، استفاده کرد.

تجزیه و تحلیل سمیت سلولی آپتامر

روش‌های تجربی مختلفی برای آنالیز سمیت سلولی آپتامر وجود دارد که برای ارزیابی اثرات آپتامرها بر بقا، تکثیر یا عملکرد سلول طراحی شده‌اند.

روش ها	مقدمه تفصیلی	مزیت	نقطه ضعف
روش تشخیص MTT	سنجش MTT روشی مبتنی بر فعالیت آنزیمی در میتوکندری سلول‌های زنده است. سوکسینات دهیدروژناز موجود در میتوکندری سلول های زنده می تواند MTT اگزوژن را به کریستال آبی-بنفش نامحلول در آب تبدیل کند و آن را در سلول رسوب کند، در حالی که سلول های مرده چنین عملکردی ندارند. حل کردن این کریستال ها توسط دی متیل سولفوکسید (DMSO) و تشخیص جذب در طول موج های خاص (مانند 490 نانومتر یا 570 نانومتر) روی آنزیمولتر می تواند به طور غیرمستقیم تعداد سلول های زنده را منعکس کند و در نتیجه سمیت سلولی آپتامر را ارزیابی کند.	حساسیت بالا، اقتصادی و راحتی	حجم کار سنگین، حلال های آلی ممکن است باعث آسیب به سلول ها شود. فقط نتایج آزمایشی نهایی را می توان به دست آورد و روند کامل سمیت سلولی را نمی توان مشاهده کرد
روش تشخیص CCK-8	Cell Counting Kit-8 (CCK-8) یک روش تشخیص رنگ سنجی با حساسیت بالا و غیر رادیواکتیو است. CCK-8 حاوی WST-8 است که توسط دهیدروژناز در میتوکندری سلول های زنده کاهش می یابد تا سوخت متیل زان نارنجی رنگ بسیار محلول در آب تولید کند. مقدار رنگ مزان تولید شده به طور خطی با تعداد سلول های زنده مرتبط است و تعداد سلول های زنده را می توان با اندازه گیری مقدار جذب نور رنگ مزان در طول موج 450 نانومتر به طور غیر مستقیم منعکس کرد تا سمیت سلولی آپتامر ارزیابی شود.	عملیات ساده، بدون نیاز به شستشوی سلول ها، تشخیص سریع، محدوده تشخیص خطی گسترده، حساسیت بالا، تکرارپذیری خوب، سمیت سلولی کم	قیمت معرف بالا؛ گاهی اوقات تشخیص اینکه کاهش جذب به دلیل کاهش تعداد سلول های زنده است یا کاهش فعالیت خود سلول دهیدروژناز مشکل است.
روش تشخیص LDH	LDH (لاکتات دهیدروژناز) آنزیمی است که در سیتوپلاسم سلول ها پایدار است و هنگامی که غشای سلولی آسیب می بیند، LDH در خارج از سلول آزاد می شود. LDH می تواند اسید لاکتیک را کاتالیز کند تا پیروات تشکیل دهد و با INT (نمک های تترازولیوم) واکنش داده و ماده کریستالی بنفش را تشکیل دهد. با اندازه گیری میزان جذب آن در یک طول موج خاص (مانند 490 نانومتر)، می توان درجه آسیب سلولی را منعکس کرد و سپس سمیت سلولی آپتامر را ارزیابی کرد.	این به طور مستقیم میزان مرگ سلول ها را منعکس می کند و آسیب کمتری به سلول ها وارد می کند و هیچ گونه آلودگی ایزوتوپ رادیواکتیو وجود ندارد.	نیاز به خارج کردن مکرر سلول ها از انکوباتور، عملیات پیچیده تر است. فقط نتایج آزمایشی نهایی را می توان به دست آورد و روند کامل سمیت سلولی را نمی توان مشاهده کرد
تجزیه و تحلیل تصویربرداری سلول زنده در زمان واقعی	با استفاده از تحلیلگر تصویربرداری زنده سلولی بلادرنگ، این ابزار در انکوباتور قرار گرفت تا کل فرآیند چرخه رشد سلولی را در زمان واقعی مشاهده و ثبت کند. سمیت سلولی آپتامرها را می توان با تجزیه و تحلیل تغییرات مورفولوژیکی و منحنی های رشد سلول ها ارزیابی کرد. این روش می‌تواند نتایج ویدئویی و کمی فرآیندهای سیتوتوکسیک را ارائه دهد و در عین حال محیط رشد سلولی را پایدار نگه دارد.	این می تواند فرآیند سیتوتوکسیک را در زمان واقعی، تصویربرداری غیر مخرب نظارت کند، تداخل و آسیب به سلول ها را کاهش دهد. هم نتایج ویدئویی و هم نتایج کمی برای تجزیه و تحلیل عمیق در دسترس هستند.	هزینه تجهیزات بالا است و به مهارت های عملیاتی حرفه ای و توانایی تجزیه و تحلیل داده ها نیاز دارد

کاچی

مزیت خدمات تحقیقاتی آپتامر

کنترل کیفیت جامع

آپتامرهای بهینه شده با پایداری بالاتر

اقتصادی و کارآمد. قیمت رقابتی تر، خدمات بهتر

سایت های تحقیقاتی جامع و روش های تحقیقاتی متعدد

مشاوره حرفه ای قبل از فروش و خدمات پشتیبانی پس از فروش

تجربه غنی در تجزیه و تحلیل آپتامر

تیم تحقیق و توسعه سطح بالا

خدمات سفارشی مربوط به آپتامر

بازگشت به صفحه پلتفرم توسعه آپتامر

اگر سوالی دارید، لطفا در هر زمان با ما تماس بگیرید.

Leave Your Message

خدمات ویژه

0102