سرویس تجزیه و تحلیل برهمکنش پروتئین-پروتئین

آلفا لایف‌تک همچنین می‌تواند برای رفع نیازهای آزمایشگاهی مشتریان مختلف، سنجش‌های پروتئین، آنالیز برهمکنش پروتئین، سنجش برهمکنش پروتئین-پروتئین (CO-IP، وسترن بلات، سنجش ایمونوپرسیپیتاسیون کروماتین) و سنجش عملکرد پروتئین را به مشتریان ارائه دهد.

تماس با ما

سرویس تجزیه و تحلیل برهمکنش پروتئین-پروتئین

شرکت آلفا لایف‌تک سال‌هاست که عمیقاً درگیر سنجش پروتئین است و پلتفرمی مطمئن برای سنجش عملکرد پروتئین ساخته و به ابزارهای فنی متنوعی برای تأیید برهمکنش پروتئین تسلط یافته است که می‌تواند ضمن ارائه نتایج پایدار، در زمان تحقیقات علمی یا تحقیقات پروژه صرفه‌جویی کند.

مقدمه‌ای بر سنجش برهمکنش پروتئین-پروتئین

پروتئین‌ها مهم‌ترین مولکول‌های اجرایی در هر شکلی از حیات هستند که به دستورالعمل‌های ذخیره شده در مواد ژنتیکی پاسخ می‌دهند. پروتئین‌ها اغلب وظایف خود را با ایفای نقش به عنوان بازیگرانی که با سایر پروتئین‌ها تعامل دارند، انجام می‌دهند، که این امر زمانی آشکارتر می‌شود که عملکرد یک پروتئین در بافت واقعی یک سلول بررسی شود. شناسایی تعاملات بین پروتئین‌ها برای بررسی بیوشیمی یک پروتئین واحد بسیار مهم است. تجزیه و تحلیل تعاملات پروتئین از انواع رایج به شرح زیر است:

سنجش هم‌ایمونوپرسیپیتاسیون

اصل روش کو-ایمونوپرسیپیتاسیون این است که پروتئین هدف، آنتی‌بادی اختصاصی و دانه‌های مغناطیسی پروتئین A/G را برای انکوباسیون مخلوط می‌کنند، مایع رویی پروتئین متصل نشده از طریق جذب دانه‌های مغناطیسی روی قفسه مغناطیسی دور ریخته می‌شود و دانه‌های مغناطیسی شسته می‌شوند تا پروتئین و سایر ناخالصی‌ها، مگر اینکه به طور خاص متصل شده باشند، حذف شوند.

شکل 1 نمودار شماتیک سنجش‌های Co-IP.(منبع مرجع: سنجش هم‌ایمونوپرسیپیتاسیون - PubMed (nih.gov))

سنجش به پایین کشیدن

روش سنجش pull-down به این صورت است که پروتئین شناخته شده را روی مهره مغناطیسی ثابت کرده و ماده مورد نظر را اضافه می‌کند. شوینده برای جذب پروتئین‌های برهمکنش کننده شناسایی می‌شود.

در سال ۱۹۸۸، اسمیت و همکارانش پروتئین فیوژن GST را خالص‌سازی کردند که در سنجش‌های pull-down به کار گرفته شد و Gst pull down نامیده می‌شود. این روش به معنای اضافه کردن یک برچسب GST به پروتئین هدف، جذب پروتئین برهمکنش‌کننده از طریق GSH، شستشوی اتصال و تأیید آن از طریق سنجش‌های WB است.

شکل 2 نمودار شماتیک سنجش‌های کششی GST.(منبع مرجع: سنجش کشش GST برای مطالعه اتصال PIF4 در شرایط آزمایشگاهی - PubMed (nih.gov) )

راهکار او استفاده از یون‌های فلزی مانند نیکل یا کبالت به عنوان واسطه، خالص‌سازی پروتئین از طریق کروماتوگرافی میل ترکیبی و شستشوی اتصال از طریق آزمایش WB برای تأیید است.

علاوه بر این، روش‌های دیگری مانند DNA Pull-down (سنجش اتصال پروتئین به DNA)، RNA Pull-down (سنجش برهمکنش پروتئین به RNA) و سنجش‌های کوچک مولکول Pull-down نیز وجود دارد.

DNA Pull-down (سنجش اتصال پروتئین به DNA) یک روش آزمایشگاهی برای تعیین اتصال DNA به پروتئین است. اینکه آیا پروتئین‌های خاص به DNA هدف متصل می‌شوند یا خیر، توسط سنجش‌های WB شناسایی شد؛ قطعات DNA ناشناخته متصل به پروتئین‌ها، که قطعات DNA با تشخیص MS مشخص می‌شوند.

RNA Pull-down (سنجش برهمکنش RNA پروتئین) یک روش آزمایشگاهی برای تعیین اتصال RNA به پروتئین‌ها است. اینکه آیا پروتئین‌های خاص به RNA هدف متصل می‌شوند یا خیر، توسط سنجش‌های WB شناسایی شد؛ قطعات RNA ناشناخته متصل به پروتئین‌ها، که قطعات RNA با تشخیص MS شناخته می‌شوند.

روش SM pull-down (سنجش‌های پایین‌کشی مولکول‌های کوچک) می‌تواند پروتئین‌های هدفی را پیدا کند که به‌طور خاص به مولکول‌های کوچک متصل می‌شوند و هنگامی که با طیف‌سنجی جرمی (MS) ترکیب می‌شود، پروتئین‌های هدف مولکول‌های کوچک را می‌توان به‌طور دقیق غربالگری کرد که می‌توان آن را به روش برچسب‌گذاری آزمایشگاهی (in vitro) و روش متعامد بیولوژیکی تقسیم کرد.

آزمایش WB

آزمایش WB (که با نام آزمایش وسترن بلات یا وسترن بلات نیز شناخته می‌شود)، جوهره آن واکنش اختصاصی آنتی‌ژن و آنتی‌بادی است. اصل اساسی آن جداسازی پروتئین‌های دناتوره شده از طریق الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید SDS و انتقال آن به یک حامل فاز جامد (مانند غشای PVDF، غشای NC) از طریق انتقال غشا (چرخش مرطوب یا نیمه‌خشک) است. پس از بلوک کردن (با استفاده از BSA، دوغ و غیره)، آنتی‌بادی اولیه برای اتصال اختصاصی به پروتئین اعمال می‌شود و آنتی‌بادی ثانویه نشاندار شده با فلورسین پس از شستشوی فیلم اضافه می‌شود. با اتصال آنتی‌بادی دوم به آنتی‌بادی اولیه، پروتئین هدف را می‌توان با ایجاد رنگ سوبسترا و نورتابی شیمیایی مشاهده کرد. این آزمایش عموماً برای تعیین بیان یک پروتئین خاص در نمونه و تجزیه و تحلیل تقریبی سطح بیان آن استفاده می‌شود.

مقایسه روش برهمکنش پروتئین-پروتئین

سنجش‌های پایین‌کشی پروتئین مشابه سنجش‌های Co-IP هستند که هر دو به آزمایش‌های تشخیص برهمکنش پروتئین تعلق دارند. تفاوت بین این دو روش این است که سنجش‌های Co-IP پروتئین‌های برهمکنش‌کننده پروتئین‌های شناخته‌شده را به دست می‌آورند که اعتبار خاصی دارد اما نمی‌تواند تأیید کند که آیا پروتئین‌های برهمکنش‌کننده به طور مستقیم یا غیرمستقیم برهمکنش می‌کنند. سنجش‌های پایین‌کشی برای یافتن پروتئین ناشناخته در حال برهمکنش با پروتئین شناخته‌شده است. این روش می‌تواند مستقیماً تأیید کند که آیا پروتئین شناخته‌شده با پروتئین شناسایی‌شده برهمکنش می‌کند یا خیر، اما نمی‌تواند وضعیت اتصال را در داخل بدن (in vivo) مشخص کند.

فناوری Co-immunoprecipitation برای تجزیه و تحلیل وجود برهمکنش بین دو یا چند پروتئین، بر اساس آزمایش‌های immunoprecipitation، استفاده می‌شود. در مقایسه با سایر تکنیک‌های تجربی تجزیه و تحلیل برهمکنش پروتئین (GST Pull-down، Western Blot، Chromatin immunoprecipitation assay و غیره)، فناوری Co-IP از ویژگی، حساسیت و تکرارپذیری بالاتری برخوردار است که می‌تواند از تداخل اتصال غیر اختصاصی جلوگیری کرده و برهمکنش پروتئین‌ها را در حالت طبیعی منعکس کند.

	پایین کشیدن GST	کو-آی‌پی	بانک جهانی
مزیت	کارکرد آسان مناسب برای خالص‌سازی پروتئین‌های مختلف	برای تحلیل برهمکنش درون‌تنی می‌توان آن را با پروتئین پایین‌دست شناسایی کرد	ویژگی قوی کیفی و کمی در شرایط آزمایشگاهی (in vitro)
محدودیت	شاید اتصال غیر اختصاصی اعتبارسنجی بیشتر تعامل مورد نیاز است	وابستگی شدید به آنتی‌بادی‌ها ممکن است اتصال غیر اختصاصی رخ دهد	زمان‌بر بودن استفاده از آن برای آنالیز پروتئین در مقیاس بزرگ دشوار است
مثال کاربردی	* شناسایی تعاملات * کمپلکس پروتئین خالص شده	مطالعه انتقال سیگنال مکانیسم بیماری	تجزیه و تحلیل بعدی برهمکنش‌های پروتئین-پروتئین، پروتئین-DNA و پروتئین-RNA