خدمات غربالگری کتابخانه نمایش سطح مخمر
آلفا لایفتک در ساخت کتابخانه نمایش مخمر و غربالگری کتابخانههای آنتیبادی تخصص دارد و قابلیت تولید اشکال مختلف کتابخانههای مخمر و غربالگری آنها برای آنتیبادیهای با میل ترکیبی بالا و اختصاصی را برای مشتریان در سراسر جهان ارائه میدهد. با تیمی از محققان متخصص، فناوری و تجهیزات پیشرفته، میتوانیم کتابخانههای مخمر را با هدف قرار دادن طیف وسیعی از پروتئینهای مرتبط با بیماری بسازیم. ما میتوانیم فناوریهای نمایش فاژ و نمایش مخمر، از جمله نمایش مخمر پروتئینی، نمایش مخمر مولکول کوچک، نمایش مخمر آنتیبادی و غیره را ارائه دهیم.
کتابخانههای نمایش مخمر ما از ظرفیت و تنوع بالایی برخوردارند که پایه و اساس محکمی را برای غربالگری مؤثر توالیهای آنتیبادی اختصاصی فراهم میکنند. ما میتوانیم اشکال مختلفی از کتابخانههای نمایش مخمر آنتیبادی (کتابخانههای آنتیبادی IgG، scFv، VHH، Fab)، کتابخانههای پروتئینی، کتابخانههای پپتیدی، کتابخانههای cDNA و غیره را بر اساس نیاز شما بسازیم. علاوه بر این، ما میتوانیم کتابخانههای آنتیبادی با خواص مختلف، از جمله کتابخانههای ایمنی، کتابخانههای طبیعی، کتابخانههای مصنوعی، کتابخانههای نیمه مصنوعی و کتابخانههای آنتیبادی بیماری را نیز توسعه دهیم.
مقدمهای بر سیستم نمایش مخمر
فناوری نمایش سطح مخمر روشی برای نمایش پروتئینهای نوترکیب روی سطح مخمر از طریق ادغام ژن است. رایجترین سیستم نمایش مخمر از پروتئین هدف متصل به انتهای C زیر واحد Aga2p پروتئین جفتگیری آلفا لکتین استفاده میکند که عمدتاً از برچسبهای اپیتوپ در دو طرف پروتئین هدف تشکیل شده است: برچسب هماگلوتینین (HA) با 9 اسید آمینه در انتهای N و برچسب c-myc با 10 اسید آمینه در انتهای C. زیر واحد 69 اسید آمینهای Aga2p از طریق دو پیوند دیسولفیدی به زیر واحد 725 اسید آمینهای آلفا لکتین Aga1p متصل میشود و Aga1p از طریق پیوند کووالانسی β 1،6-گلوکان به دیواره سلولی متصل میشود. بنابراین، پروتئین هدف روی سطح سلولهای مخمر نمایش داده میشود و متعاقباً توسط لیگاند مربوطه شناسایی میشود. پروتئینهای عملکردی را از طریق غربالگری فلوسایتومتری از کتابخانهها جدا کنید.

شکل ۱: اصل نمایش سطح مخمر. (منبع شکل: کاربردهای نمایش سطح مخمر برای مهندسی پروتئین)
مقدمهای بر کتابخانه نمایش سطح مخمر
مرتبسازی نمایش مخمر بر اساس نمایش سطح مخمر است که عمدتاً برای غربالگری کتابخانههای آنتیبادی که پروتئینهای سطح سلول را هدف قرار میدهند، استفاده میشود. با توجه به اتصال غیر اختصاصی کم بین سلولهای مخمر و سایر سطوح سلولی، انتخاب بیولوژیکی مخمر میتواند کتابخانههای اتصال بزرگ را برای یافتن کلونهای نادر غربالگری کند.
خدمات غربالگری کتابخانه نمایش سطح مخمر
پلاسمیدها را آماده کرده و سلولهای مخمر را کشت دهید، DNA کدکننده پروتئین هدف را سنتز کنید و آن را در یک وکتور بیان مخمر حاوی پروموترهای القایی، پپتیدهای سیگنال و ژنهای هدف متصل به پروتئینهای نمایش سطحی (مانند Aga2p) کلون کنید. ژن کدکننده پروتئین هدف را میتوان با ژن کدکننده پروتئین دیواره سلولی مخمر (معمولاً Aga2p) ترکیب کرد و ژن ترکیبشده را میتوان از طریق الکتروپوریشن به سلولهای مخمر تبدیل کرد. پس از ترانسفورماسیون، سلولهای مخمر که ژنهای آنتیبادی را روی سطح خود بیان میکنند، میتوانند تحت آزمایشهای غربالگری اختصاصی آنتیژن قرار گیرند: کتابخانه مخمر با آنتیژن هدف انکوبه میشود و سلولهای مخمری که بهطور خاص به آن متصل میشوند، انتخاب میشوند. با استفاده از مرتبسازی سلولی فعالشده با فلورسانس (FACS) برای جداسازی سلولهای مخمر که پروتئینهایی با ویژگیهای مورد نظر را نشان میدهند، غربالگری کتابخانه نمایش مخمر را میتوان با حداکثر اندازه کتابخانه حدود 10 ^ 8-10 ^ 9 سلول مخمر انجام داد. سپس کلونهای مثبت را میتوان برای تجزیه و تحلیل بیشتر یا کاربردهای پاییندستی جدا کرد. پس از شناسایی کلونهای آنتیبادی اختصاصی از کتابخانه آنتیبادی، میتوان آنها را بیشتر توصیف و به صورت انبوه تولید کرد و با استفاده از تکنیکهایی مانند کروماتوگرافی میل ترکیبی پروتئین A/G، کل فرآیند غربالگری نمایش مخمر و تولید آنتیبادی را تکمیل کرد.
فرآیند غربالگری کتابخانه نمایش مخمر

شکل 2 فرآیند غربالگری کتابخانه نمایش مخمر
گردش کار سرویس غربالگری کتابخانه نمایش مخمر
| مراحل | محتوای خدمات | گاهشمار |
|---|---|---|
| آمادهسازی آنتیژن | نوع آنتیژن: اگر مشتری بتواند آنتیژنها را ارائه دهد، نمونههای مربوطه باید بر اساس نوع تحویل داده شوند: پروتئینهای نوترکیب به ۳ تا ۳.۵ میلیگرم با خلوص بالای ۸۵٪ نیاز دارند، مولکولهای کوچک باید با خلوص بالای ۹۰٪ کونژوگه شوند، سنتز پپتید باید با خلوص بالای ۹۰٪ کونژوگه شود، انواع نمونهها مانند ویروسها باید غیرفعال شوند، RNA باید برای جلوگیری از تخریب بررسی شود و انواع آنتیژنهای فوق نیز میتوانند برای سنتز سفارشی شوند. | ۲-۳ هفته |
| ایمنی حیوانات | تعداد واکسیناسیون حیوانات ۵ مورد است و لازم است بر اساس آزمایش تیتر سرم، افزایش تعداد واکسیناسیونها تعیین شود. ایمنی آنتیژنی: قدرت آنتیژن پروتئین/ویروس>۱۰۵؛ قدرت آنتیژن پپتید/مولکول کوچک>۱۰^۴ | ۵-۶ هفته |
| آمادهسازی cDNA الگو | سلولهای تک هسته ای خون محیطی (PBMC) پلاسما را جدا کنید، RNA کل را (کیت استخراج RNA) استخراج کنید و به cDNA تبدیل کنید. | ۱ روز |
| ساخت کتابخانه | با استفاده از cDNA کتابخانه به عنوان الگو، ژن VHH با دو دور PCR تکثیر شد و وکتور نمایش پیرایش ژن VHH مخمر ساخته شد. وکتور با استفاده از الکتروپوریشن به سلولهای مخمر تبدیل شد تا یک کتابخانه آنتیبادی ساخته شود. به طور تصادفی ۴۸ کلون انتخاب و میزان مثبت (>۹۰٪) را با استفاده از روش PCR شناسایی کنید. ظرفیت کتابخانه (۱۰^۷-۱۰^۸)، توالییابی NGS را برای تعیین میزان صحیح درج کتابخانه (>۹۰٪) و تنوع کتابخانه محاسبه کنید. | ۲ هفته |
| غربالگری کتابخانه | سه دور غربالگری پیشفرض: غربالگری پروتئین نشاندار شده با فلورسانس FACS، و به دنبال آن تعیین توالی NGS در دور سوم. کلونهای مثبت برای بیان القایی تک گرم و تشخیص ELISA انتخاب شدند. همه کلونهای مثبت برای تعیین توالی ژن انتخاب شدند و توالیهای مختلف ناحیه CDR انتخاب شدند. | ۲-۳ هفته |
| تأیید آنتیبادی | ساخت وکتورهای بیانی مناسب برای توالیهای آنتیبادی میتواند بیان آنتیبادی، خالصسازی آنتیبادی، اعتبارسنجی اتصال آنتیژن آنتیبادی با ELISA و BLI برای تأیید میل ترکیبی آنتیبادی و انسداد فلوسایتومتری برای تأیید عملکرد سلول را تسهیل کند. | ۱ هفته |
غربالگری کتابخانه نمایش سطح مخمر مورد
در مقالات مربوط به پلتفرم نمایش سطح مخمر برای کشف سریع نانوبادیهای با ساختار انتخابی، نویسندگان یک پلتفرم کامل کشف نانوبادی در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) بر اساس نمایش سطح مخمر ایجاد کردند. ابتدا، یک کتابخانه نانوبادی مصنوعی با شروع از ژنهای شتر طراحی شد. شکل D نشان میدهد که نانوبادی دارای یک برچسب HA در انتهای کربوکسیل است و سپس نانوبادی به صورت کووالانسی روی دیواره سلولی مخمر تثبیت میشود. شکل E فرآیند غربالگری نانوبادی را نشان میدهد. نانوبادیهای مخمر با میل ترکیبی آنتیژن، توسط FACS جداسازی، تکثیر و بارها برای آنتیبادیها انتخاب شدند. نویسندگان نانوبادیهای انتخابی ساختار یافتهای را کشف کردند که از طریق این پلتفرم، دو GPCR مختلف انسانی را هدف قرار میدهند.

شکل 3: طراحی و ساخت کتابخانه نانوبادی مصنوعی. (منبع شکل: پلتفرم نمایش سطح مخمر برای کشف سریع نانوبادیهای با ساختار انتخابی)
اگر سوالی دارید، لطفا در هر زمانی با ما تماس بگیرید.
Leave Your Message
0102







2018-07-16 

