Monoklonaalisten vasta-aineiden kehityspalvelu

Alpha Lifetech Inc.voi tarjota epitooppiennusteita, peptidisynteesiä, proteiinien ilmentämistä, polyklonaalisten tai monoklonaalisten vasta-aineiden tuotantoa sekä vasta-aineiden puhdistusta soluviljelmästä, askitesnesteestä tai koko seerumista.

Alpha Lifetech Inc.on kokenut tarjoamaan asiakkaille erilaisia stabiileja solulinjoja, kuten hybridoomasoluja, genominmuokkaussolulinjoja, alasajosolulinjoja ja yliekspressiosolulinjoja. Pyrimme tarjoamaan edistyneitä räätälöityjä solulinjapalveluita jokaiselle asiakkaalle, ja palvelumme ovat todistetusti luotettavia.

Vasta-aineiden kehitysstrategia

1. Antigeenin suunnittelu ja valmistus
Nämä antigeenit voivat olla proteiineja, peptidejä tai muita molekyylejä. Immunogeenien suunnittelu vaatii kokonaisvaltaisen lähestymistavan, joka yhdistää tietämyksen antigeenin rakenteesta, immunologiasta ja kuljetusjärjestelmistä. Alpha Lifetechillä on antigeenien suunnitteluteknologiaa, jonka avulla voidaan suunnitella immunogeenejä niitä tarvitseville asiakkaille.
Alpha Lifetech tarjoaa asiakkaille rekombinanttiproteiinituotteita. Meillä on laaja valikoima proteiinien ilmentämisjärjestelmiä, kuten E. coli -ilmentämisjärjestelmä, hiivailmentämisjärjestelmä, bakulovirus-hyönteisilmentämisjärjestelmä, nisäkäsilmentämisjärjestelmä jne., tutkimukseen tarvitsemiesi rekombinanttiproteiinien tuottamiseen.

2. Eläinten immunisointi
Alpha Lifetech voi toimittaa immunogeenejä asiakkaille, ja valittavana on immuuneja eläimiä, kuten hiiriä, kaneja, lampaita, alpakoja, marsuja, hamstereita jne.

3. Monoklonaalisten vasta-aineiden tuotantomenetelmät

●Mab-solujen tuotanto hybridooma-teknologialla
Hybridooma on hybridisolu, joka syntyy fuusioimalla kahdenlaisia soluja, nimittäin hiiren myeloomasolulinjaa ja plasmasoluja (lymfosyytti B), joissa heterotsygoottinen solu voi tuottaa jatkuvasti vasta-aineita kiinnostuksen kohteena olevaa antigeenia vastaan in vitro. Hybridoomasolulinjan tuotanto koostuu kolmesta osasta: antigeenin suunnittelusta (hapteenit, pienet molekyylit ja peptidit), eläinten immunisoinnista, solufuusiosta ja positiivisten kloonien seulonnasta. Ainutlaatuisten immunisointimenetelmien avulla saavutamme poikkeuksellisen korkean solufuusiotehokkuuden (1–10 hybridoomaa tuhatta B-solua kohden) ja korkeat vasta-ainetiitterit, mikä maksimoi onnistumisprosenttimme myöhemmissä analyyttisissä testeissä, joihin kuuluvat biokemiallinen seulonta, in vitro -solupohjaiset määritykset ja eläinkokeet.

●Mab-vasta-aineiden tuotanto faaginäyttötekniikalla
Faaginäyttö tarjoaa toisen menetelmän monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen. B-lymfosyytit eristetään eläimen verestä ja niiden mRNA uutetaan. PCR:n avulla tämä mRNA muunnetaan cDNA:ksi, joka monistaa kaikki VH- ja VL-segmentit. Nämä segmentit kloonataan sitten vektoriin, tyypillisesti yksiketjuisina variaabelifragmentteina (scFv), bakteriofagin PIII-proteiinin rinnalle. Myöhemmin tätä konstruktiota käytetään E. colin infektointiin, jolloin auttajafaagilla inokuloimalla saadaan noin 10^10 solua sisältävä kirjasto. E. coli pystyy sitten erittämään bakteriofagin, jonka kuoressa on VH- ja VL-segmentit. Tämän jälkeen voidaan valita spesifiset VH- ja VL-segmentit, jotka kohdistuvat kiinnostuksen kohteena olevaan antigeeniin, ja käyttää niitä E. colin uudelleeninokuloimiseksi bakteriofagilla. Plasmidin sisältävät solut eristetään ja sekvensoidaan sitten.

4. Fuusioseulonta

●Solufuusio ja valinta
Kerätyt B-solut fuusioidaan sitten myeloomasolujen kanssa, jotka ovat syöpäsoluja, jotka voivat lisääntyä rajattomasti viljelmässä. Fuusio tehdään tyypillisesti esimerkiksi polyetyleeniglykoli-(PEG-)fuusiolla.
Fuusion jälkeen hybridoomasoluja viljellään selektiivisessä elatusaineessa, joka sallii vain hybridoomien selviytymisen. Elatusaine sisältää yleensä aminopteriiniä, joka estää fuusioitumattomien myeloomasolujen kasvun.

●Seulonta ja tukkeutuminen
Tuloksena olevat hybridoomasolut seulotaan kohdeantigeenille spesifisten vasta-aineiden tuotannon varalta. Tämä tehdään tyypillisesti käyttämällä tekniikoita, kuten entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA), Western blot, immunosaostus ja virtaussytometria.

Kun vasta-ainetta tuottavat hybridoomasolut on tunnistettu, ne kloonataan identtisten solujen populaation luomiseksi. Tämä varmistaa, että jokaisen hybridoomasolun tuottama vasta-aine on identtinen.

5. Vasta-aineiden toiminnan varmentaminen
Alpha Lifetech tarjoaa vasta-aineiden toiminnallista validointia, kuten Western-blottausta, immunohistokemiaa tai toiminnallisia määrityksiä, monoklonaalisten vasta-aineiden karakterisoimiseksi ja vasta-aineiden spesifisyyden, affiniteetin ja toiminnallisuuden varmistamiseksi.

6. Vasta-aineiden optimointi
Vasta-aineiden puhdistaminen viljelmäsupernatantista käyttämällä tekniikoita, kuten proteiini A- tai proteiini G -affiniteettikromatografia, ja Alpha Lifetech voi myös tarjota vasta-aineiden modifikaatiomenetelmiä vasta-aineiden affiniteetin parantamiseksi.

7. Vasta-aineiden tuotanto
Alpha Lifetech voi arvioida vasta-ainekandidaatteja suuren läpimenon seulontatarpeita ja laajamittaista tuotantoa varten.

usein kysytyt kysymyksetusein kysytyt kysymykset

Monoklonaalisten vasta-aineiden kehittämisen usein kysytyt kysymykset

1

Kuinka valita oikea fuusiohybridooma?

Fuusioprosessin aikana 10–15 96-kuoppaista mikrotiitterilevyä kylvetään fuusiohybridiseoksella. Jokaiselle levylle syötetään HAT-IMDM-valintaelatusainetta ja sitä säilytetään hiilidioksidiinkubaattorissa 37 celsiusasteessa. 9–14 päivää fuusion jälkeen hybridisupernatantit testataan kiinnostuksen kohteena olevan spesifisen vasta-aineen esiintymisen varalta.
2

Miten valinnan tehokkuutta voidaan parantaa?

Plasmasolujen fuusio myeloomasolujen kanssa ei ole 100 % tehokasta. Jopa optimaalisissa olosuhteissa ja tehokkaimmalla stimulaatiolla solufuusio tuottaa silti sekoituksen konfluentteja ja konfluentteja soluja, jotka on eroteltava. Valintaprosessin tehokkuuden parantamiseksi fuusiossa käytetyistä myeloomasoluista puuttuu HGPRT, joka on keskeinen entsyymi nukleotidien pelastusreitillä. Seosta viljeltiin sitten HAT-elatusaineessa, jossa vain HGPRT-entsyymiä sisältävät solut, eli plasmasoluilta HGPRT:n perineet hybridoomat, olivat elinkelpoisia.
3

Miten hybridoomasolulinjoja seulotaan vasta-aineaktiivisuuden suhteen?

Hybridilajikkeiden arviointi on ratkaiseva vaihe. Yleensä hybridooma-, klooni- ja alakloonisupernatantin seulonta tehdään entsyymi-immunosorbenttimäärityksellä (ELISA), Western blot -määrityksellä ja fluoresenssiaktivoidulla solulajittelulla (FACS). Päätämme suorittaa kaikki supernatantin seulonnat omassa laboratoriossamme.
4

Antakaa yksityiskohtaiset ohjeet vasta-aineaktiivisuuden seulonnan suorittamiseksi?

Testattavia hybridooma-supernatteja voi olla 500–1 440 näytettä, ja ne ovat valmiita testattavaksi päivinä 9–14. Testit voivat kestää kolmesta viiteen päivään tai kaikki näytteet voivat olla valmiita samana päivänä, joten on tärkeää, että asiakaslaboratorio on valmistautunut viikkoja etukäteen toimivien valittujen toissijaisten seulontamääritysten kanssa.
5

Miksi positiiviset hybridoomit täytyy subkloonata?

Kun positiiviset kuopat oli tunnistettu alustavan ELISA-seulonnan aikana, hybridoomat siirrettiin suurempaan tilavuuteen, eli 24-kuoppaisille levyille, subkloonausmenettelyn valmistelua varten. Hybridoomien subkloonaus suoritetaan yleensä rajoitetun laimennuksen menetelmällä stabiilien monokloonien eristämisen varmistamiseksi. Tekniikkaan kuuluu hybridoomaviljelmien laimentaminen ja dispergointi 96-kuoppaisille levyille monoklonaalisuuden saavuttamiseksi (yksi solu kuoppaa kohden). Sekalaisten hybridoomapopulaatioiden kehittymisriskin vähentämiseksi tulisi suorittaa vähintään kaksi rajoitettua laimennusta.
6

Mitä hyötyä hybridoomateknologian käytöstä vasta-aineiden löytämisessä on?

Hybridisolulinjoja on kiitetty niiden kyvystä tuottaa vasta-aineita, joilla on korkea affiniteetti, stabiilius ja spesifisyys kustannustehokkaimmalla tavalla.