Plateforme de mesure d'affinité

S'appuyant sur les plateformes Octet et Biacore-T2000, Alpha Lifetech propose des services fiables de détermination d'affinité. Nous réalisons cette détermination pour de nombreux types d'échantillons, tels que les anticorps, les cellules, les protéines, les petites molécules, etc. Différentes méthodes sont disponibles, notamment la résonance plasmonique de surface (SPR) et l'interférence de couche biologique (BLI).

Alpha Lifetech dispose d'une plateforme professionnelle et précise de détermination d'affinité, combinant ELISA et détermination d'affinité. Cette plateforme fournit des résultats professionnels, efficaces, rapides et précis à ses clients du monde entier. Deux méthodes sont proposées : la détermination d'affinité rapide et la détermination d'affinité précise. La détermination d'affinité rapide porte sur une concentration unique, tandis que la détermination d'affinité précise permet de mesurer l'affinité à différentes concentrations. Cette plateforme s'applique à l'étude des interactions entre diverses petites molécules, peptides, protéines, oligonucléotides et oligomères, ainsi que lipides, bactériophages, virus et cellules. Elle constitue une base solide pour les tests et le criblage de médicaments par affinité, la découverte d'anticorps et facilite les recherches ultérieures.

Introduction à l'affinité de liaison

L'affinité est un paramètre important pour évaluer les interactions intermoléculaires, les tests d'affinité des médicaments et le criblage de médicaments. Les interactions intermoléculaires peuvent être décrites par l'équation : L + R = LR, où L représente les ligands libres, R les récepteurs non liés et LR les complexes ligand-récepteur liés. Les réactions de liaison définissent les interactions intermoléculaires ; un échange dynamique se produit entre les états liés et non liés au cours de la réaction, jusqu'à l'atteinte de l'équilibre. Ce phénomène est décrit par les deux constantes de vitesse de la réaction : K_on (constante de vitesse de liaison) et K_off (constante de vitesse de dissociation). La valeur de K_d, inverse de la constante de liaison (K_a), est égale à K_off/K_on ; il s'agit d'une constante importante pour l'affinité de la réaction. Ainsi, plus la liaison entre deux molécules est forte, plus l'affinité est élevée. Inversement, plus la valeur de K_d est faible, plus l'affinité est élevée. Cette équation peut être représentée par une courbe en S sur un graphique semi-logarithmique, avec la concentration du ligand en abscisse (échelle logarithmique) et la fraction limite en ordonnée. La ligne pointillée représente la concentration du ligand pour une constante de dissociation (Kd) de 1 nM et une fraction de liaison de 0,5.

Figure 1 : Courbe de liaison sigmoïde de différentes concentrations de ligand lié au récepteur de surface cellulaire. (Source de référence : Hunter SA, Cochran JR. Tests de liaison cellulaire pour la détermination de l'affinité des interactions protéine-protéine : technologies et considérations.)

Méthodes de détermination de l'affinité

Dosage d'affinité de liaison ELISA

La technique la plus couramment utilisée pour étudier l'affinité des anticorps repose sur la méthode ELISA, qui se caractérise par sa simplicité, sa rapidité, sa haute sensibilité et sa forte spécificité. Elle permet d'utiliser une faible quantité de réactifs (anticorps et antigènes) et de mesurer l'affinité des anticorps sans purification préalable. L'antigène est immobilisé sur un support solide et détecté par un anticorps primaire. Un anticorps secondaire marqué réagit ensuite avec l'anticorps primaire pour permettre la lecture et l'analyse des données par un lecteur ELISA.

Figure 2 : Tests de type ELISA pour évaluer la liaison des peptides conçus à leurs cibles. (Source de référence : Hajikarimlou, Maryam, et al., 2022. Une approche informatique pour concevoir rapidement des peptides qui détectent la protéine de surface S du SARS-CoV-2.)

Dosage d'affinité de liaison par résonance plasmonique de surface (SPR)

La technologie SPR détecte principalement les variations d'indice de réfraction. Grâce aux phénomènes optiques classiques et à la résonance plasmonique de surface (RPS), une technologie d'analyse biosensorielle peut être mise en œuvre pour détecter l'interaction entre ligands et analytes sur des puces de biodétection. Des signaux spécifiques de liaison et d'interaction entre biomolécules peuvent être obtenus en suivant l'évolution dynamique des angles SPR au cours des réactions biologiques.

Figure 3 : Analyse par résonance plasmonique de surface (RPS) de la liaison H10/AGR2. (Source de référence : Garri, Carolina, et al., 2018. Identification, caractérisation et application d'un nouveau peptide contre l'homologue 2 du gradient antérieur (AGR2).)

Test d'affinité de liaison par interférence de couche biologique (BLI)

La technologie d'interférence de biofilm est une technique de détection optique sans marquage et en temps réel, principalement utilisée pour l'analyse quantitative complète des interactions intermoléculaires et la détermination de la concentration protéique. Cette technologie utilise un biocapteur à sonde pour détecter directement les variations d'épaisseur du biofilm sur l'échantillon. En détectant les variations de déplacement du spectre d'interférence, on détecte la liaison et la dissociation des biomolécules interagissant à la surface du capteur, et le déplacement en temps réel (nm) du spectre d'interférence est affiché.

Figure 4 : Analyse par interférométrie de biolayer (BLI) entre l’aLDRG et les chitino-oligosaccharides. (Source de référence : Li, Bing, 2023. Caractéristiques du transcriptome comparatif entre les rhizomorphes et les hyphes d'Armillaria sp. 541 participant à la symbiose fongique avec un accent sur les domaines LysM.)

Comparaison des technologies BLI et SPR

Nom de la technologie	BLI (Interférométrie de la couche biologique)	SPR (Résonance plasmonique de surface)
Principe	Ce dispositif mesure les variations de la figure d'interférence de la lumière réfléchie à la surface du capteur, détectant les interactions moléculaires par le biais des variations d'épaisseur optique de la couche biologique. Il fournit une courbe de liaison en temps réel (mesure directe).	Ce dispositif mesure les interactions moléculaires en détectant les variations de l'indice de réfraction à proximité de la surface de la puce (lorsque la lumière interagit avec l'interface or/verre, provoquant des modifications de l'indice de réfraction). Les données sont reflétées par les variations de l'angle de résonance (mesure indirecte).
Fabricant	Sartorius	GE
Instrument	Biosenseurs ForteBio	Instrument SPR ouvert
Système	Système ForteBio Octet (pour l'analyse des interactions moléculaires)	TraceDrawer (développé par Ridgeview Instruments, Suède)
Avantages	1. Compatibilité étendue avec différents types d'échantillons, excellente stabilité, notamment pour la détection de petites molécules (les exigences spécifiques en matière de pureté de l'échantillon et de conditions de tampon sont moins strictes). Les puces SSA sont économiques pour les études de liaison. 2. Débit plus rapide et temps expérimentaux plus courts comparés à la SPR.	1. Un historique de développement plus long, offrant une sensibilité plus élevée par rapport à BLI. 2. Une précision et une robustesse accrues pour des applications spécifiques, telles que la détection de protéines rares ou précieuses avec des données d'affinité et de spécificité plus élevées.
Inconvénients	1. Précision des données légèrement inférieure à celle du SPR. 2. Nécessite un entretien rigoureux de l'instrument. 3. Le coût des puces SSA est relativement élevé.	1. Les conditions de tampon pour la détection de très petites molécules peuvent être exigeantes, augmentant ainsi le risque d'échec de détection. 2. Les puces sont généralement plus chères que celles utilisées dans le BLI. 3. L'évaporation des échantillons lors d'expériences prolongées peut constituer un problème.
Type de puce	Puce SSA	NTA Chip

Portée de la mesure d'affinité

La détermination de l'affinité peut concerner les interactions antigène-anticorps (interactions fortes ou faibles), protéine-protéine, protéine-peptide, protéine-petite molécule et protéine-ADN/ARN (aptamère). Pour mesurer la constante de dissociation (KD), il est nécessaire de connaître l'une des concentrations molaires. Lors de la liaison de petites molécules, la masse moléculaire de l'une d'entre elles ne peut être inférieure à 150 daltons.

Taper	Portée	Précautions
1. Antigène-anticorps	10^-6 à 10^-12	La plupart des anticorps ont une constante de dissociation (Kd) comprise entre 10⁻⁶ et 10⁻⁷. On considère généralement que les anticorps à haute affinité ont une Kd inférieure à 10⁻⁹, tandis que les anticorps à faible affinité ont une Kd inférieure à 10⁻¹².
2. Protéines - Petites molécules	10^-4 à 10^-5	Le KD des petites molécules et des protéines se situe entre 10^-4 et 10^-5, tandis que 10^-3 et 10^-7 sont normaux et ne peuvent pas atteindre 10^-10. Les petites molécules covalentes peuvent atteindre 10^-10.
3. Avidine-Biotine	10^-14	L'affinité peut facilement subir une liaison non spécifique, et l'affinité de la streptavidine ou déglycosylée peut être utilisée.
4. ADN-Protéine	10^-8 à 10^-10	ADN de haute qualité et complet ; veiller à éviter toute influence de l'électrophorèse.

Exigences relatives aux échantillons pour la détermination de l'affinité

Échantillon	Exigences
1. Échantillon de grosse molécule	Protéines > 50 µg, anticorps > 100 µg, protéines biotinylées > 200 µg ; protéines non biotinylées > 2 mg, pureté requise > 90 %, solution tampon : PBS, HEPBS. Ne doit pas contenir de groupes imidazole ; un contrôle qualité est requis.
2. Échantillon de petite molécule	Quantité > 1 mg, sous forme de poudre ou de liquide (ce dernier doit être soluble dans l'eau ou le DMSO). Éviter la présence de glycérol, d'imidazole, de tréhalose ou d'autres sels ; privilégier les tampons contenant des groupements aminés comme le Tris (généralement PBS, HEPP, etc.) sans réactifs organiques.

Avantages de la plateforme de mesure d'affinité

Analyse d'échantillons multiples

Alpha Lifetech peut fournir des tests d'affinité pour divers échantillons, notamment des anticorps, des cellules, des protéines et d'autres biomolécules.

Plateforme technologique mature

Nous disposons de technologies avancées telles que le test de liaison SPR, le test de liaison BLI et le test de liaison ELISA.

Sélection de projet flexible

Les clients peuvent choisir entre une détermination rapide de l'affinité et une détermination précise de l'affinité.

Résultats de haute précision

Notre équipe technique professionnelle garantit des résultats de détermination d'affinité efficaces, précis et fiables.

Étude de casCAS

Test d'affinité rapide BLI pour les anticorps et les aptamères

Capturez les aptamères biotinylés spécifiques de la sonde SA et dissolvez-les. Dissolvez et diluez l'échantillon à une concentration fixe, solidifiez les aptamères cibles 1 à 5 capturés spécifiquement par la sonde et, après saturation du signal, liez-les à l'échantillon. Ajoutez ensuite ces aptamères à une plaque 96 puits.

Figure 5 : Distribution des positions de détection pour les échantillons de plaques 96 puits. B désigne le tampon utilisé pour l’équilibrage et la dissociation des capteurs. L : aptamères cibles de la biotine 1 à 5 ; 221 : échantillon.

Veillez à effectuer un forage précis afin de garantir la stabilité et la précision des données, et configurez le programme correspondant pour obtenir les résultats :

Figure 6 : Diagramme d’ajustement de l’interaction entre les aptamères cibles 1, 2 et 3 et les échantillons. (CH 1 \ 3 \ 5 représente le signal et les données de l’interaction entre la sonde d’aptamères cibles 1 \ 2 \ 3 solidifiée et l’échantillon.)

Figure 7 : Diagramme d’ajustement de l’interaction entre les aptamères cibles 4 et 5 et les échantillons. (CH 1 \ 3 représente le signal et les données de l’interaction entre la sonde d’aptamère cible 4 \ 5 solidifiée et l’échantillon.)

Les résultats montrent

Les résultats suivants ont été obtenus : l’affinité de l’adaptateur de la cible 1 pour l’échantillon après ajustement était de 9,41 ^ -8 ; l’affinité de l’adaptateur de la cible 2 pour l’échantillon après ajustement est de 8,32 ^ -8 ; l’affinité de l’adaptateur de la cible 3 pour l’échantillon après ajustement est de 8,64 ^ -8 ; l’affinité de l’adaptateur de la cible 4 pour l’échantillon après ajustement est de 3,70 ^ -8 ; l’affinité de l’adaptateur de la cible 5 pour l’échantillon après ajustement est de 3,01 ^ -8.

Si vous avez des questions, n'hésitez pas à nous contacter à tout moment.

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