Service de recherche sur les aptamères

Introduction aux aptamères

Les aptamères sont des molécules d'acide nucléique simple brin (comme l'ADN ou l'ARN) sélectionnées in vitro à partir d'une banque d'oligonucléotides synthétiques à séquences aléatoires, par un processus appelé criblage SELEX, qui comprend plusieurs cycles de sélection itératifs. Les principaux services de développement d'aptamères proposés par Alpha Lifetech incluent la construction de banques d'aptamères, le criblage SELEX, le séquençage SELEX, l'analyse de séquence et d'autres analyses d'aptamères.

Le séquençage SELEX associe le criblage SELEX d'aptamères et le séquençage à haut débit. Grâce au séquençage SELEX d'aptamères, la séquence spécifique de l'aptamère lié à la cible peut être déterminée efficacement, fournissant ainsi des données essentielles pour l'analyse et l'application ultérieures de la séquence d'aptamère.

Les aptamères sont largement utilisés dans la recherche scientifique, le traitement des maladies, la conception de biocapteurs, la découverte de médicaments et la surveillance environnementale. Cependant, les aptamères oligonucléotidiques sélectionnés in vitro se dégradent facilement in vivo et peuvent même présenter une toxicité. Par conséquent, après l'optimisation des aptamères sélectionnés, une analyse in vitro est nécessaire pour évaluer la réussite de leur développement. Afin de répondre aux différents besoins d'analyse de ses clients, Alpha Lifetech propose diverses stratégies d'analyse d'aptamères.

Figure 1. Schéma d'analyse des aptamères. Source de référence :Thevendran R, Citartan M. 2022. Tests d'estimation de l'affinité de liaison des aptamères.

Présentation du service de recherche sur les aptamères

Analyse de la stabilité des aptamères

Expérience de dégradation par nucléase

En incubant l'aptamère avec différents types de nucléases (DNase, RNase, etc.) dans des conditions spécifiques, on observe sa dégradation, ce qui permet d'évaluer sa résistance à la dégradation. Ceci est utile pour déterminer la stabilité et la durabilité de l'aptamère dans des applications pratiques.

méthode de marquage fluorescent

La stabilité de l'aptamère est évaluée indirectement en marquant ses fluorophores et en observant les variations du signal de fluorescence avant et après sa liaison à la cible. Par exemple, lorsqu'un aptamère se lie à une cible, sa conformation peut changer, ce qui entraîne une augmentation ou une diminution du signal de fluorescence.

Analyse de la stabilité thermique

La stabilité thermique de l'aptamère est évaluée en mesurant la variation de sa température de fusion (valeur Tm) à différentes températures. Plus la température de fusion de l'aptamère est élevée, meilleure est sa stabilité thermique.

analyse de stabilité dynamique

La résonance plasmonique de surface (SPR) et d'autres technologies ont été utilisées pour surveiller en temps réel le processus de liaison et de découplage entre l'aptamère et la cible, obtenir des paramètres dynamiques (tels que la constante de vitesse de liaison, la constante de vitesse de dissociation, etc.), mieux comprendre le mécanisme d'interaction entre l'aptamère et la cible et évaluer sa stabilité dynamique.

Analyse de la stabilité structurelle

La cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire (RMN) et d'autres techniques de biologie structurale ont été utilisées pour analyser la structure tridimensionnelle de l'aptamère et sa stabilité structurale.

Analyse spécifique des aptamères

Test de liaison d'aptamères

L'affinité est évaluée par un test de liaison d'aptamères permettant de mesurer la constante de liaison entre l'aptamère et la molécule cible, telle que la constante de dissociation Kd. Une valeur de Kd plus faible indique une affinité plus élevée. Ce test permet de sélectionner des candidats médicaments présentant une forte affinité, puis de réaliser des études pharmacodynamiques et pharmacocinétiques.

expérience de criblage inverse

Le criblage inverse est une méthode permettant d'éliminer rapidement les molécules non cibles parmi un grand nombre de molécules candidates. Il vise à exclure les molécules ne possédant pas la propriété ou la fonction recherchée. La clé du criblage inverse réside dans la sélection de marqueurs ou de conditions appropriés permettant d'identifier et d'éliminer les molécules non cibles au cours du processus de criblage. Dans cette expérience, la sélection des molécules non cibles est primordiale. Il convient de s'assurer que les molécules non cibles sélectionnées sont représentatives des substances susceptibles d'interférer avec le criblage des aptamères et que les facteurs d'interférence potentiels sont pris en compte de manière exhaustive.

Expérience d'inhibition compétitive

L'ajout d'un nombre excessif de compétiteurs (tels que des molécules de structure similaire à la molécule cible) au système de liaison entre l'aptamère et la molécule cible permet d'observer une modification de leur affinité. Si cette affinité est significativement réduite, cela indique une spécificité élevée de l'aptamère.

Dans certains cas, les expériences d'inhibition compétitive peuvent être utilisées dans le cadre ou en complément des expériences de criblage inverse. Par exemple, lors du criblage de médicaments, la capacité d'une molécule médicamenteuse à se lier à la protéine cible peut être évaluée par des expériences d'inhibition compétitive, puis des expériences de criblage inverse peuvent être utilisées pour éliminer les composés présentant une trop forte affinité pour les cellules ou les tissus sains.

Analyse de la cytotoxicité des aptamères

Il existe diverses méthodes expérimentales pour l'analyse de la cytotoxicité des aptamères, conçues pour évaluer les effets des aptamères sur la survie, la prolifération ou la fonction cellulaire.

Méthodes	Introduction détaillée	Avantage	Inconvénient
Méthode de détection MTT	Le test MTT est une méthode basée sur l'activité enzymatique des mitochondries de cellules vivantes. La succinate déshydrogénase mitochondriale réduit le MTT exogène en formazan, un cristal bleu-violet insoluble dans l'eau, et le dépose à l'intérieur de la cellule. Cette fonction est absente dans les cellules mortes. La dissolution de ces cristaux par le diméthylsulfoxyde (DMSO) et la mesure de l'absorbance à des longueurs d'onde spécifiques (490 nm ou 570 nm, par exemple) sur un lecteur de microplaques permettent d'estimer indirectement le nombre de cellules vivantes et ainsi d'évaluer la cytotoxicité de l'aptamère.	Haute sensibilité, économie et commodité	Une charge de travail importante et l'utilisation de solvants organiques peuvent endommager les cellules ; seuls les résultats expérimentaux finaux sont disponibles, et le processus complet de cytotoxicité ne peut être observé.
Méthode de détection CCK-8	Le kit de comptage cellulaire CCK-8 est une méthode de détection colorimétrique non radioactive à haute sensibilité. Le CCK-8 contient du WST-8, qui est réduit par la déshydrogénase mitochondriale pour produire un colorant orange, le méthylzan, très soluble dans l'eau. La quantité de méthylzan produite est proportionnelle au nombre de cellules vivantes, lequel peut être indirectement estimé en mesurant l'absorption du méthylzan à 450 nm, permettant ainsi d'évaluer la cytotoxicité de l'aptamère.	Utilisation simple, pas besoin de laver les cellules, détection rapide, large plage de détection linéaire, haute sensibilité, bonne répétabilité, faible cytotoxicité	Prix élevé des réactifs ; il est parfois difficile de déterminer si la diminution de l’absorbance est due à une baisse du nombre de cellules vivantes ou à une baisse de l’activité de la déshydrogénase cellulaire elle-même.
Méthode de détection de la LDH	La LDH (lactate déshydrogénase) est une enzyme stable dans le cytoplasme cellulaire. Lorsque la membrane cellulaire est endommagée, la LDH est libérée hors de la cellule. Elle catalyse la transformation de l'acide lactique en pyruvate et réagit avec l'INT (sels de tétrazolium) pour former une substance cristalline violette. La mesure de son absorbance à une longueur d'onde spécifique (par exemple 490 nm) permet d'évaluer le degré de dommage cellulaire et, par conséquent, la cytotoxicité de l'aptamère.	Il reflète directement le taux de mortalité cellulaire, endommage moins les cellules et ne présente aucune contamination par des isotopes radioactifs.	La nécessité de sortir fréquemment les cellules de l'incubateur complexifie l'opération ; seuls les résultats expérimentaux finaux peuvent être obtenus, sans pouvoir observer l'intégralité du processus de cytotoxicité.
Analyse d'images cellulaires en temps réel	Grâce à un analyseur d'imagerie cellulaire en temps réel, l'instrument a été placé dans un incubateur afin d'observer et d'enregistrer l'intégralité du cycle de croissance cellulaire en temps réel. La cytotoxicité des aptamères peut être évaluée par l'analyse des modifications morphologiques et des courbes de croissance des cellules. Cette méthode permet d'obtenir des résultats vidéo et quantifiés des processus cytotoxiques tout en maintenant un environnement de culture cellulaire stable.	Elle permet de suivre le processus cytotoxique en temps réel, grâce à une imagerie non destructive, réduisant ainsi les interférences et les dommages aux cellules ; les résultats vidéo et quantifiés sont disponibles pour une analyse approfondie.	Le coût de l'équipement est élevé et son utilisation requiert des compétences professionnelles en matière d'exploitation et d'analyse de données.

KACHI

Avantages du service de recherche sur les aptamères

Contrôle total de la qualité

Aptamères optimisés à stabilité accrue

Économique et efficace. Prix plus compétitif, meilleur service.

Sites de recherche exhaustifs et méthodes de recherche multiples

Services professionnels de consultation avant-vente et d'assistance après-vente

Solide expérience en analyse d'aptamères

Équipe de R&D de haut niveau

Services personnalisés liés aux aptamères

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Si vous avez des questions, n'hésitez pas à nous contacter à tout moment.

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