Plateforme de tri de cellules B uniques

Les anticorps monoclonaux (AcM), pionniers des médicaments à base d'anticorps, comptent plus de 100 anticorps approuvés pour le traitement du cancer et des maladies infectieuses. Leur développement s'est également imposé sur le marché des médicaments, démontrant ainsi leur valeur thérapeutique unique. La technologie d'isolement d'anticorps à partir de cellules B uniques, une technologie de nouvelle génération, permet d'isoler efficacement et rapidement les anticorps à partir de cellules B individuelles. Il s'agit d'une avancée majeure dans la production d'anticorps, après les techniques d'hybridome et de phage display. Le tri de cellules B uniques permet la production d'anticorps contre de nombreuses espèces, telles que le lapin, la souris, le chameau, le mouton et le poulet. Cette technologie présente des avantages remarquables, notamment une spécificité, une activité et une affinité élevées. Grâce à sa plateforme de tri de cellules B uniques, Alpha Lifetech bénéficie d'un gain de temps considérable et d'une meilleure qualité d'anticorps. L'entreprise propose des services complets, incluant la conception, la synthèse et la modification d'antigènes, l'immunodéficience animale, le criblage d'enrichissement de cellules B uniques, le séquençage unicellulaire, le criblage à haut débit, l'expression et la purification. Elle offre également des services techniques intégrés, tels que la vérification fonctionnelle, afin de répondre aux besoins variés de ses clients.

Résumé des techniques de dépistage des cellules B uniques

Les méthodes de criblage de lymphocytes B uniques se divisent principalement en deux catégories : l’isolement aléatoire et l’isolement antigénique sélectif. L’isolement aléatoire est adapté aux échantillons à forte concentration, tandis que l’isolement antigénique sélectif ne permet d’isoler que les lymphocytes B. Simple à mettre en œuvre, il est cependant fastidieux et souvent utilisé comme première étape de la séparation antigénique spécifique. Cette dernière est particulièrement adaptée aux échantillons présentant une faible concentration d’anticorps spécifiques, tels que les anticorps antitumoraux et les auto-anticorps. L’isolement de lymphocytes B spécifiques, basé sur le principe immunologique de la liaison spécifique antigène-anticorps, est relativement complexe. Le tableau ci-dessous présente les méthodes de classification les plus courantes, ainsi que leurs avantages et inconvénients.

	Approches	Avantages	Inconvénients
Aléatoire Isolement	Micromanipulation	exigences en matière d'équipement faibles Fonctionnement simple	faible efficacité Types limités de cellules isolées
	microdissection par capture laser	Haute précision de positionnement Fonctionnement simple Sélectionner visuellement les cellules similaires de l'échantillon et éliminer les impuretés.	Processus complexe de préparation des échantillons Incapacité à automatiser
	Tri cellulaire par fluorescence	Haute précision et efficacité Haut degré d'automatisation Large application	Opération complexe exigences élevées en matière d'équipement
Isolement sélectif de l'antigène	Antigènes marqués par fluorochrome via multiparamètre	Haute précision et efficacité Haut degré d'automatisation haut débit et multiparamètre Capacité d'isoler les lymphocytes B à différents stades	Opération complexe exigences élevées en matière d'équipement
	billes magnétiques recouvertes d'antigène	Fonctionnement simple Répétabilité élevée Peut enrichir les cellules B cibles	Opération complexe Les billes magnétiques affectent l'activité biologique des cellules et ne sont pas propices à la culture et à la manipulation après isolement.
	Microgravure	Haute efficacité Grande vitesse	exigences élevées en matière d'équipement faible efficacité
	Test Immunospot sur puce	Haut degré d'automatisation Haute précision et efficacité	Opération complexe coût élevé

Processus de dépistage d'anticorps sur une seule cellule B

Immunisation animale

Sélectionner l'antigène approprié pour les animaux d'expérience (tels que les souris, les lapins, etc.) en vue de la stimulation immunitaire, afin qu'ils puissent produire des anticorps spécifiques contre l'antigène.

L'immunisation animale est la première étape de la production d'anticorps. Elle repose sur le mécanisme de réponse immunitaire humorale de l'organisme : grâce à une stimulation antigénique continue, les animaux développent une forte réponse immunitaire et sécrètent ensuite des anticorps spécifiques contre des antigènes spécifiques.

Collecte et enrichissement des lymphocytes B

Des lymphocytes B ont été isolés du sang périphérique, de la rate ou des ganglions lymphatiques d'animaux immunisés. Ces lymphocytes B ont été stimulés immunologiquement pour produire des anticorps contre des antigènes spécifiques.

Par des méthodes physiques ou chimiques (telles que la centrifugation en gradient de densité, la séparation par billes magnétiques, etc.), l'enrichissement des cellules B, l'élimination des cellules impures, l'amélioration de la pureté des cellules B et l'efficacité de la séparation ultérieure.

Figure 1. Clonage et préparation d'un anticorps monoclonal de lapin. Source de référence :Clonage de cellules B uniques et production d'anticorps monoclonaux de lapin.)

tri des lymphocytes B

Le tri cellulaire par activation de fluorescence (FACS), la séparation magnétique des cellules (MACS), le trieur de cellules microfluidique (MCS) ou d'autres techniques de criblage à haut débit, combinées à un marquage spécifique de l'antigène, peuvent être utilisées pour sélectionner des cellules B individuelles parmi des cellules B enrichies afin de produire des anticorps ciblés.

Lorsqu'une cellule B est isolée d'une population mixte de cellules B, ses gènes d'anticorps doivent être séquencés par la technologie de séquençage unicellulaire et analysés afin d'obtenir les informations de séquence d'ADN des régions variables de la chaîne lourde (VH) et de la chaîne légère (VL). Cette technologie comprend principalement trois étapes : l'isolement de la cellule unique, l'amplification des acides nucléiques intracellulaires et l'analyse de séquence. Le principe du séquençage unicellulaire est d'amplifier les traces d'ADN ou d'ARN du génome entier de cellules uniques isolées afin d'obtenir un génome ou un transcriptome complet avec une couverture élevée pour un séquençage à haut débit.

Le criblage à haut débit permet d'obtenir simultanément les séquences génétiques d'anticorps de milliers de lymphocytes B, accélérant considérablement la découverte d'anticorps. Ces informations de séquence peuvent ensuite être utilisées pour la construction et le criblage de banques d'anticorps.

Fig. 2 Schéma de la capture d'une seule cellule B, de la construction de la bibliothèque, du criblage à haut débit et du séquençage.(Source de référence : Le séquençage massivement parallèle des récepteurs des lymphocytes B à l'échelle de la cellule unique permet la découverte rapide d'anticorps réactifs à divers antigènes..)

Amplification du gène des anticorps

Une seule cellule B est clivée pour libérer de l'ARNm. Ensuite, les séquences d'ADNc des régions variables de la chaîne lourde (VH) et de la chaîne légère (VL) ont été amplifiées par transcription inverse suivie d'une réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR).

Expression et purification des anticorps

Le gène de la région variable amplifiée a été inséré dans le plasmide vecteur contenant le gène de la région constante afin de construire le plasmide d'expression de l'anticorps monoclonal. Ensuite, le système d'expression approprié (système eucaryote tel que les cellules CHO ou système procaryote tel qu'Escherichia coli) a été sélectionné pour l'expression, et l'anticorps monoclonal biologiquement actif a été obtenu. La chromatographie d'affinité sur protéine A a été utilisée pour extraire et purifier les anticorps exprimés à partir de la culture cellulaire et obtenir des anticorps monoclonaux recombinants de haute qualité.

Validation des anticorps

La validation des anticorps (spécificité, affinité et activité biologique) par ELISA, Western blot, cytométrie de flux et immunoprécipitation permet de s'assurer que leurs performances sont conformes aux attentes. Cette validation est une étape essentielle pour garantir la qualité et la fiabilité des anticorps.

Exigences relatives à l'immunogène

(1) Protéine recombinante : ≥ 2,5 mg, pureté protéique > 85 %, masse moléculaire protéique supérieure à 10 kDa, concentration protéique soluble comprise entre 0,5 et 5 mg/mL. Si une purification par affinité pour l’antigène est requise, 10 mg supplémentaires de protéine recombinante sont nécessaires.

(2)Polypeptides et petites molécules : Peptide nu ≥10 mg, pureté du peptide >90 %, pas moins de 10 AA, couplage KLH/BSA/OVA ou autres protéines porteuses ; Les petites molécules nécessitent une évaluation structurelle au préalable.

Flux de travail du service de tri de cellules B uniques

Mesures	Contenu du service	Chronologie
Étape 1 : Immunisation animale et détection par ELISA	(1)Les animaux ont été immunisés 4 à 5 fois, à partir de la 4ème dose, le sérum a été collecté pour la détection ELISA du titre d'anticorps (titre sérique ELISA de l'antigène protéique >10^5 ; titre sérique ELISA de l'antigène peptidique >10^4). Dans le même temps, 0,1 ml de sérum pré-immunisation et post-immunisation sont envoyés aux clients pour analyse ; si le titre n'est pas conforme, la vaccination se poursuit ou le client demande l'arrêt du projet, et seule la partie vaccination sera facturée ; (2)Si le titre était qualifié, les cellules PBMC étaient isolées à partir du sang total.	10 à 12 semaines
Étape 2 : Tri des cellules B individuelles	(1)La rate a été prélevée, une suspension de cellules B uniques a été préparée, du sang périphérique a été prélevé et les cellules PBMC ont été isolées. (2) Marqueurs immunoantigéniques FITC et AF648. (3) Tri par flux de fluorescence double + culture d'un seul clone de cellules b. (4) Identification ELISA + séquençage des clones positifs.	2 à 3 semaines
Étape 3 : Expression et validation des anticorps	(1) Synthèse de gènes de séquence 6-10 + validation du test d'expression mammifère. (2) Identification ELISA.	3 à 4 semaines
Étape 4 : Livraison	(1) Séquences d'anticorps : 4 à 6 séquences d'anticorps (les séquences non exprimées sont livrées ensemble). (2) Chaque séquence exprimée a délivré 0,2 mg d'anticorps. (3) Rapport expérimental.	1 semaine