Service de criblage de bibliothèques d'affichage de surface de levure

Alpha Lifetech est spécialisée dans la construction de banques de levures pour le display et le criblage de banques d'anticorps. Elle permet de générer différentes formes de banques de levures et de les cribler pour détecter des anticorps spécifiques et à haute affinité pour des clients du monde entier. Grâce à une équipe de chercheurs experts, à une technologie et à des équipements de pointe, nous pouvons construire des banques de levures ciblant un large éventail de protéines liées à des maladies. Nous proposons des technologies de phage display et de levure display, notamment pour le protein-levure display, le small molecule-levure display, le anticorps-levure display, etc.

Nos banques d'anticorps de levure présentent une grande capacité et une grande diversité, ce qui constitue une base solide pour le criblage efficace de séquences d'anticorps spécifiques. Nous pouvons construire différentes formes de banques d'anticorps de levure (IgG, scFv, VHH, Fab), de protéines, de peptides, d'ADNc, etc., selon vos besoins. Nous pouvons également développer des banques d'anticorps aux propriétés variées, notamment des banques immunitaires, naturelles, synthétiques, semi-synthétiques et d'anticorps pathogènes.

Introduction au système d'affichage de levure

La technologie d'affichage de surface de levure est une méthode d'affichage de protéines recombinantes à la surface de la levure par fusion génique. Le système d'affichage le plus courant utilise la protéine cible fusionnée à l'extrémité C-terminale de la sous-unité Aga2p de la protéine d'accouplement de la lectine alpha. Ce système est principalement constitué d'épitopes de part et d'autre de la protéine cible : l'étiquette hémagglutinine (HA) de 9 acides aminés en N-terminal et l'étiquette c-myc de 10 acides aminés en C-terminal. La sous-unité Aga2p de 69 acides aminés se lie à la sous-unité Aga1p de la lectine alpha de 725 acides aminés par deux ponts disulfures, et Aga1p est ancrée à la paroi cellulaire par une liaison covalente β-1,6-glucane. Ainsi, la protéine cible est affichée à la surface des cellules de levure et ensuite reconnue par le ligand correspondant. Séparer les protéines fonctionnelles des banques par criblage par cytométrie de flux.

Fig 1 : Principe de l'affichage de la surface de la levure. (Source de la figure :Applications de l'affichage de surface de levure pour l'ingénierie des protéines.)

Introduction à la bibliothèque d'affichage de surface de levure

Le tri par affichage des levures repose sur l'affichage de la surface des levures, principalement utilisé pour cribler des banques d'anticorps ciblant les protéines de surface cellulaire. Grâce à la faible liaison non spécifique entre les cellules de levure et les autres surfaces cellulaires, la sélection biologique des levures permet de cribler de grandes banques de liaisons pour trouver des clones rares.

Service de criblage de bibliothèques d'affichage de surface de levure

Préparer des plasmides et cultiver des cellules de levure, synthétiser l'ADN codant pour la protéine cible et le cloner dans un vecteur d'expression de levure contenant des promoteurs inductibles, des peptides signaux et des gènes cibles fusionnés à des protéines de surface (comme Aga2p). Le gène codant pour la protéine cible peut être fusionné avec celui codant pour la protéine de paroi de levure (généralement Aga2p), et le gène fusionné peut être transformé en cellules de levure par électroporation. Après transformation, les cellules de levure exprimant des gènes d'anticorps à leur surface peuvent subir des tests de criblage antigénique spécifique : la banque de levure est incubée avec l'antigène cible et les cellules de levure qui s'y lient spécifiquement sont sélectionnées. Grâce au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler les cellules de levure présentant des protéines aux caractéristiques souhaitées, le criblage de la banque de levure peut être réalisé avec une taille maximale de banque d'environ 10^8-10^9 cellules de levure. Les clones positifs peuvent ensuite être isolés pour des analyses ultérieures ou des applications en aval. Une fois que des clones d'anticorps spécifiques sont identifiés à partir de la bibliothèque d'anticorps, ils peuvent être davantage caractérisés et produits en masse, puis purifiés à l'aide de techniques telles que la chromatographie d'affinité protéine A/G pour compléter l'ensemble du processus de criblage d'affichage de levure et de production d'anticorps.

Processus de criblage des bibliothèques d'affichage de levure

Fig.2 Processus de criblage de la bibliothèque d'affichage de levure

Flux de travail du service de criblage de bibliothèques d'affichage de levures

Mesures	Contenu du service	Chronologie
Préparation de l'antigène	Type d'antigène : si le client peut fournir des antigènes, les échantillons correspondants doivent être livrés en fonction du type : les protéines recombinantes nécessitent 3 à 3,5 mg avec une exigence de pureté de plus de 85 %, les petites molécules doivent être conjuguées avec une exigence de pureté de plus de 90 %, la synthèse peptidique doit être conjuguée avec une exigence de pureté de plus de 90 %, les types d'échantillons tels que les virus doivent être inactivés, l'ARN doit être inspecté pour éviter la dégradation, et les types d'antigènes ci-dessus peuvent également être personnalisés pour la synthèse.	2-3 semaines
Immunité animale	Le nombre d'animaux vaccinés est de 5, et il est nécessaire de déterminer s'il convient d'augmenter le nombre de vaccinations en fonction des titrages sériques. Immunité antigénique : activité antigénique protéique/virale > 10 º ; activité antigénique peptidique/à petite molécule > 10 º º.	5-6 semaines
Préparation du modèle d'ADNc	Séparez les PBMC plasmatiques, extrayez l'ARN total (kit d'extraction d'ARN) et inversez-le en ADNc.	1 jour
Construction de la bibliothèque	En utilisant l'ADNc de la banque comme matrice, le gène VHH a été amplifié par deux cycles de PCR, et un vecteur d'épissage du gène VHH a été construit. Ce vecteur a été transformé en cellules de levure par électroporation pour constituer une banque d'anticorps. Quarante-huit clones ont été sélectionnés aléatoirement et le taux de positivité (> 90 %) a été déterminé par PCR. La capacité de la banque (10^7-10^8) a été calculée et le séquençage NGS a permis de déterminer le taux d'insertion correct (> 90 %) et la diversité de la banque.	2 semaines
Projection en bibliothèque	Trois cycles de criblage par défaut : criblage FACS des protéines marquées par fluorescence, suivi d'un séquençage NGS au troisième cycle. Les clones positifs ont été sélectionnés pour l'expression par induction d'un seul gramme et la détection par ELISA. Tous les clones positifs ont été sélectionnés pour le séquençage génétique, et différentes séquences de régions CDR ont été sélectionnées.	2-3 semaines
Vérification des anticorps	La construction de vecteurs d'expression appropriés pour les séquences d'anticorps peut faciliter l'expression des anticorps, la purification des anticorps, la validation ELISA et BLI de la liaison antigène-anticorps pour vérifier l'affinité des anticorps et le blocage par cytométrie de flux pour valider la fonction cellulaire.	1 semaine

Cas de criblage d'une bibliothèque d'affichage de surface de levure

Dans la littérature sur les plateformes d'affichage de surface de levure pour la découverte rapide de nanocorps conformationnellement sélectifs, les auteurs ont établi une plateforme complète de découverte de nanocorps in vitro basée sur l'affichage de surface de levure. Tout d'abord, une bibliothèque de nanocorps synthétiques a été conçue à partir de gènes de chameau. La figure D montre que le nanocorps possède une étiquette HA à l'extrémité carboxyle, puis qu'il est fixé de manière covalente sur la paroi cellulaire de levure. La figure E illustre le processus de criblage des nanocorps. Des nanocorps de levure présentant une affinité antigénique ont été isolés, amplifiés et sélectionnés à plusieurs reprises pour la recherche d'anticorps par FACS. Les auteurs ont découvert des nanocorps conformationnellement sélectifs ciblant deux récepteurs GPCR humains différents grâce à cette plateforme.

Fig 3 : Conception et construction d'une bibliothèque de nanocorps synthétiques. (Source de la figure :Plateforme d'affichage de surface de levure pour la découverte rapide de nanocorps conformationnellement sélectifs.)

Avantages de l'affichage de levure

Nous sommes capables de construire des bibliothèques de levures avec une capacité de bibliothèque allant jusqu'à 10^9, avec un taux d'insertion et une diversité de 100 %.