Service de criblage de la bibliothèque d'affichage de surface de levure

Alpha Lifetech est spécialisée dans la construction et le criblage de banques d'anticorps par la technique du phage display, offrant ainsi à ses clients du monde entier la possibilité de générer différents types de banques de levures et de les cribler pour identifier des anticorps spécifiques et à haute affinité. Grâce à une équipe de chercheurs experts et à des technologies et équipements de pointe, nous sommes en mesure de construire des banques de levures ciblant un large éventail de protéines impliquées dans diverses maladies. Nous proposons des technologies de phage display et de levure display, notamment le phage display de protéines, de petites molécules et d'anticorps.

Nos banques d'expression sur levure présentent une grande capacité et une diversité élevée, ce qui constitue une base solide pour le criblage efficace de séquences d'anticorps spécifiques. Nous pouvons construire différents types de banques d'expression sur levure (IgG, scFv, VHH, Fab), des banques de protéines, de peptides, d'ADNc, etc., selon vos besoins. De plus, nous pouvons également développer des banques d'anticorps aux propriétés variées, notamment des banques d'anticorps immunologiques, naturels, synthétiques, semi-synthétiques et des banques d'anticorps spécifiques de maladies.

Introduction au système d'affichage des levures

La technologie d'affichage à la surface de la levure (YES) est une méthode permettant d'exposer des protéines recombinantes à la surface de la levure par fusion de gènes. Le système d'affichage le plus courant utilise la protéine cible fusionnée à l'extrémité C-terminale de la sous-unité Aga2p de la lectine alpha, une protéine d'accouplement. Cette fusion est principalement constituée de deux étiquettes d'épitope : une étiquette hémagglutinine (HA) de 9 acides aminés en N-terminal et une étiquette c-myc de 10 acides aminés en C-terminal. La sous-unité Aga2p, composée de 69 acides aminés, se lie à la sous-unité Aga1p de la lectine alpha (725 acides aminés) par deux ponts disulfure, et Aga1p est ancrée à la paroi cellulaire par une liaison covalente β-1,6-glucane. Ainsi, la protéine cible est exposée à la surface des cellules de levure et reconnue par son ligand. Les protéines fonctionnelles sont ensuite isolées des banques de protéines par criblage en cytométrie de flux.

Figure 1 : Principe de l’affichage de surface des levures. (Source de la figure : Applications de l'affichage en surface de levures pour l'ingénierie des protéines.)

Introduction à la bibliothèque d'affichage de surface de levure

Le tri par présentation sur levure repose sur l'affichage à la surface de la levure et est principalement utilisé pour cribler des banques d'anticorps ciblant des protéines de surface cellulaire. Grâce à la faible interaction non spécifique entre les cellules de levure et d'autres surfaces cellulaires, la sélection biologique sur levure permet de cribler de vastes banques d'anticorps afin d'identifier des clones rares.

Service de criblage de la bibliothèque d'affichage de surface de levure

Préparer les plasmides et cultiver les cellules de levure, synthétiser l'ADN codant pour la protéine cible et le cloner dans un vecteur d'expression de levure contenant des promoteurs inductibles, des peptides signaux et des gènes cibles fusionnés à des protéines d'expression de surface (telles que Aga2p). Le gène codant pour la protéine cible peut être fusionné avec le gène codant pour la protéine de paroi cellulaire de la levure (généralement Aga2p), et le gène de fusion peut être introduit dans les cellules de levure par électroporation. Après transformation, les cellules de levure exprimant les gènes d'anticorps à leur surface peuvent être soumises à des tests de criblage spécifiques à l'antigène : la banque de levures est incubée avec l'antigène cible et les cellules de levure qui s'y lient spécifiquement sont sélectionnées. Le tri cellulaire par cytométrie en flux (FACS) permet d'isoler les cellules de levure exprimant les protéines aux caractéristiques souhaitées, et le criblage de la banque de levures peut être réalisé avec une taille maximale de banque d'environ 10⁸ à 10⁹ cellules de levure. Les clones positifs peuvent ensuite être isolés pour des analyses complémentaires ou des applications en aval. Une fois que des clones d'anticorps spécifiques sont identifiés dans la bibliothèque d'anticorps, ils peuvent être caractérisés plus en détail, produits en masse et purifiés à l'aide de techniques telles que la chromatographie d'affinité protéine A/G pour achever le processus complet de criblage par affichage sur levure et de production d'anticorps.

Processus de sélection de la bibliothèque d'affichage de levures

Fig. 2 Processus de criblage de la bibliothèque d'affichage de levures

Flux de travail du service de criblage de la bibliothèque d'affichage de levures

Mesures	Contenu du service	Chronologie
Préparation d'antigènes	Type d'antigène : Si le client peut fournir des antigènes, les échantillons correspondants doivent être livrés en fonction du type : les protéines recombinantes nécessitent 3 à 3,5 mg avec une pureté supérieure à 85 %, les petites molécules doivent être conjuguées avec une pureté supérieure à 90 %, la synthèse peptidique doit être conjuguée avec une pureté supérieure à 90 %, les types d'échantillons tels que les virus doivent être inactivés, l'ARN doit être inspecté pour éviter toute dégradation, et les types d'antigènes ci-dessus peuvent également être personnalisés pour la synthèse.	2 à 3 semaines
Immunité animale	Le nombre d'immunisations animales est de 5. Il convient de déterminer s'il faut augmenter ce nombre en fonction des résultats des tests de titrage sérique. Immunité antigénique : puissance antigénique protéique/virale > 10⁵ ; puissance antigénique peptidique/petite molécule > 10⁴	5 à 6 semaines
Préparation de l'ADNc matrice	Séparer les PBMC plasmatiques, extraire l'ARN total (kit d'extraction d'ARN) et le convertir en ADNc.	1 jour
Construction de bibliothèques	En utilisant l'ADNc de la banque comme matrice, le gène VHH a été amplifié par deux cycles de PCR, et un vecteur d'expression chez la levure portant l'épissage du gène VHH a été construit. Ce vecteur a été transformé dans des cellules de levure par électroporation pour construire une banque d'anticorps. Quarante-huit clones ont été sélectionnés aléatoirement et leur taux de positivité (> 90 %) a été déterminé par PCR. La capacité de la banque (10⁷-10⁸) a été calculée, et un séquençage NGS a permis de déterminer le taux d'insertion correct (> 90 %) et la diversité de la banque.	2 semaines
Projection en bibliothèque	Le processus de criblage par défaut comprend trois étapes : un criblage par cytométrie de flux (FACS) de protéines marquées par fluorescence, suivi d’un séquençage NGS. Les clones positifs sont sélectionnés pour l’expression induite sur un gramme unique et la détection par ELISA. Tous les clones positifs sont ensuite sélectionnés pour le séquençage génique, et différentes séquences de régions CDR sont analysées.	2 à 3 semaines
Vérification des anticorps	La construction de vecteurs d'expression appropriés pour les séquences d'anticorps peut faciliter l'expression des anticorps, la purification des anticorps, la validation ELISA et BLI de la liaison anticorps-antigène pour vérifier l'affinité des anticorps, et le blocage par cytométrie de flux pour valider la fonction cellulaire.	1 semaine

Étude de cas de criblage de bibliothèques d'affichage de surface de levure

Dans la littérature relative aux plateformes d'expression à la surface de levures pour la découverte rapide de nanocorps conformationnellement sélectifs, les auteurs ont mis au point une plateforme complète de découverte de nanocorps in vitro basée sur l'expression à la surface de levures. Dans un premier temps, une bibliothèque de nanocorps synthétiques a été conçue à partir de gènes de chameau. La figure D montre que le nanocorps possède une étiquette HA à son extrémité C-terminale, puis qu'il est fixé de manière covalente à la paroi cellulaire de la levure. La figure E illustre le processus de criblage des nanocorps. Les levures présentant des nanocorps d'affinité pour l'antigène ont été isolées, amplifiées et sélectionnées de manière répétée par cytométrie en flux (FACS) pour la production d'anticorps. Grâce à cette plateforme, les auteurs ont découvert des nanocorps conformationnellement sélectifs ciblant deux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) humains différents.