A tecnoloxía de visualización en fagos consiste en inserir o xene diana alleo na posición específica da proteína da cápside do fago e expresar o xene alleo na superficie do fago sen afectar a función normal deste. Tras varias roldas de cribado, finalmente obtívose a proteína diana cunha forte especificidade e alta actividade biolóxica.

Con esta tecnoloxía pódense xerar bibliotecas de anticorpos de alta capacidade. O ciclo de cribado é breve, o proceso operativo é sinxelo e a gama de aplicacións é ampla, o que permite a identificación de secuencias óptimas para péptidos ou proteínas dirixidas. En aplicacións relacionadas con virus, os investigadores poden descubrir anticorpos que se unen a epítopos virais críticos mediante a cribado de grandes bibliotecas de anticorpos. Este proceso pode impedir os mecanismos de entrada, replicación ou evasión inmunitaria dos virus, establecendo así unha base para o tratamento de enfermidades.

A tecnoloxía de visualización en fagos utilízase máis amplamente que a tecnoloxía de hibridomas, que se limita a producir unha pequena cantidade de anticorpos contra inmunóxenos específicos. Pola contra, a tecnoloxía de visualización en fagos pode presentar unha biblioteca completa de anticorpos derivada de diversas especies inmunitarias.

A tecnoloxía de visualización en fagos ten unha ampla gama de aplicacións, incluíndo a detección de receptores de microorganismos patóxenos, o estudo das interaccións entre proteínas, o seguimento da transmisión de sinais entre células, o diagnóstico de enfermidades animais e o desenvolvemento de vacinas, entre outros campos.

A tecnoloxía de visualización en fagos ofrece numerosas vantaxes e pódese aplicar en varios campos. Non obstante, o principal desafío no desenvolvemento de anticorpos recombinantes mediante o método de visualización en fagos é a complexidade e o custo asociados ao proceso. Esta abordaxe require a integración de técnicas de bioloxía molecular, incluíndo mutación, clonación e expresión, xunto con análises inmunolóxicas, bioquímicas e biofísicas para identificar e caracterizar os anticorpos desexados.

A presentación de antíxenos é unha ligazón moi importante. Os métodos de presentación de antíxenos inclúen principalmente a presentación directa de antíxenos revestidos, a presentación indirecta de antíxenos revestidos, a presentación de antíxenos mediante cribado de células completas e a presentación de antíxenos mediante liposomas, discos de nanofosfolípidos e VLP.

O método de revestimento directo é relativamente sinxelo, pero a conformación do antíxeno é doada de cambiar, e a operación de revestimento indirecto é complicada, pero pode manter a conformación do antíxeno e mellorar a eficiencia da presentación. A selección celular pode simular a escena real in vivo, pero existe un problema de unión non específica. O disco de nanofosfolípidos ten un tamaño pequeno, unha alta eficiencia de subministración e unha boa estabilidade; as VLP fusiónanse con antíxeno ou envólvense con antíxeno, o que ten alta inmunoxenicidade e boa seguridade, e pode desencadear unha forte resposta inmunitaria.

Se a concentración é demasiado baixa, a probabilidade de unión co fago diminuirá, o que resultará nunha eficiencia de cribado reducida. Pola contra, unha concentración excesivamente alta pode aumentar a probabilidade de unión non específica, elevar o sinal de fondo e dificultar a identificación de clons positivos.

Pódese adoptar un método de fixación suave para evitar altas temperaturas, ácidos fortes e álcalis. Empregáronse o método de revestimento indirecto e o sistema biotina-estreptavidina para reducir os danos na estrutura do antíxeno. Se o antíxeno é unha proteína de membrana, pódese mostrar na superficie de células intactas ou usar para simular o ambiente da membrana, como un nanodisco, para manter a súa conformación natural da proteína de membrana.

Ademais de experimentos rutineiros como ELISA, Western Blotting (WB) e inmunofluorescencia (IF), pódense empregar técnicas de detección por resonancia plasmónica superficial (SPR) e interferometría de biocapa (BLI) para monitorizar os procesos de unión e disociación de anticorpos e antíxenos en tempo real, o que permite determinar a afinidade e os parámetros cinéticos.

A presentación en fagos pódese utilizar para xerar anticorpos monoclonais de alta afinidade para unha ampla gama de especies produtoras de anticorpos, incluíndo, entre outros, humanos, ratos, ratas, coellos, galiñas, camelos, alpacas, vacas, cans, ovellas, monos e tiburóns.

A tecnoloxía de construción de bibliotecas de anticorpos de rato está ben establecida, é rendible e ten unha curta duración experimental, o que a fai axeitada para a selección preliminar de anticorpos e a investigación básica. Os anticorpos de coello presentan unha forte afinidade e especificidade, cun rango de recoñecemento de epítopos máis amplo en comparación cos anticorpos de rato. Os anticorpos humanos pódense obter directamente das bibliotecas de anticorpos humanos, evitando así as posibles reaccións inmunitarias que poden ocorrer cando se administran anticorpos heterólogos ao corpo humano. Esta estratexia ten un valor significativo na investigación e desenvolvemento de fármacos, especialmente na creación de anticorpos terapéuticos.

Os inmunóxenos animais divídense xeralmente en antíxenos proteicos, antíxenos polipeptídicos, antíxenos de ácido nucleico e antíxenos relacionados con patóxenos, entre os cales os antíxenos relacionados con patóxenos inclúen antíxenos víricos (partícula vírica completa, proteína vírica, proteína non estrutural vírica, etc.), antíxenos bacterianos (extracto bacteriano completo, compoñente da parede celular, proteína secretada, toxina, etc.) e antíxenos parasitarios.

Axustar os inmunóxenos substituíndo os antíxenos inmunitarios por proteínas recombinantes e substituíndo as partículas víricas de extinción de incendios polas proteínas estruturais dos virus. Axustar o deseño experimental e modificar a dosificación inmunitaria.

A inmunoxenicidade pode mellorarse acoplando antíxenos con proteínas transportadoras, como a albumina sérica bovina. Ademais, pódense empregar adxuvantes inmunitarios, incluídos o adxuvante de Freund e o adxuvante de aluminio, para prolongar o tempo de residencia in vivo e estimular a activación e proliferación das células inmunitarias, mellorando así a inmunoxenicidade.

Unha biblioteca de anticorpos de fagos é unha colección de diversos anticorpos de fagos creada mediante a ensamblaxe dun conxunto completo de xenes de rexión variable a partir de anticorpos en vectores de fagos e a súa expresión nas superficies dos fagos. Este proceso resulta na formación dunha biblioteca de anticorpos de fagos.

O proceso xeral de presentación en fagos implica varios pasos clave: extraer células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de animais inmunizados, illar o ARN total e transcribilo en ADN complementario (ADNc), amplificar o xene diana mediante a tecnoloxía de reacción en cadea da polimerase (PCR), clonar o xene diana nun vector de fagos e transformar o vector nunha célula hóspede para a súa expresión. Este proceso resulta na construción dunha biblioteca de presentación en fagos, que pode identificar rapidamente anticorpos de alta afinidade. Posteriormente, esta biblioteca pode servir como un recurso valioso para o desenvolvemento de vacinas, fármacos terapéuticos e reactivos de diagnóstico.

Segundo a orixe da biblioteca de anticorpos, as bibliotecas de anticorpos de fagos poden clasificarse en bibliotecas de anticorpos de fagos inmunes e bibliotecas de anticorpos de fagos nativos. A principal distinción entre estes dous tipos reside en se os animais foron vacinados. Ademais, as bibliotecas de anticorpos nativos poden xerarse mediante semisíntese ou síntese.

Hai dous índices principais para avaliar a calidade dunha biblioteca de anticorpos: a capacidade de almacenamento e a diversidade. Unha gran capacidade de almacenamento, combinada cunha alta diversidade, garante a detección eficaz de anticorpos con alta afinidade e especificidade.

No proceso de elutriación biolóxica, a biblioteca de visualización incúbase con dianas fixas e logo lávase exhaustivamente para eliminar os fagos non reactivos. Os conxugados elúense normalmente cunha solución ácida ou rica en sal e posteriormente amplifícanse en células hóspedes axeitadas para o seu enriquecemento. Despois de 3 a 5 roldas de cribado, obtéñense anticorpos con alta afinidade.

Os métodos de cribado de fagos inclúen principalmente o cribado en fase sólida, o cribado en fase líquida e o cribado baseado en células. A selección dun método de cribado axeitado debe ter en conta as características das moléculas diana, os obxectivos do proceso de cribado e o ambiente do laboratorio.

A selección positiva é o método máis fundamental para a selección de anticorpos antifagos que se unen ás proteínas diana. A selección negativa serve para eliminar os anticorpos non específicos. Durante o proceso de selección de anticorpos antifagos, pódense identificar anticorpos non específicos debido á interferencia da etiqueta do antíxeno diana, materiais ou outros antíxenos con semellanzas estruturais co antíxeno diana. Nestes casos, a selección negativa pode mellorar a eficiencia do proceso de selección.

Os métodos para a verificación de anticorpos inclúen normalmente ELISA, Western Blotting (WB), citometría de fluxo, inmunoprecipitación (IP), inmunofluorescencia (IF), inmunohistoquímica e outras técnicas experimentais. Alpha Lifetech posúe unha ampla experiencia na detección de anticorpos e conta cun equipo experimental profesional, o que garante a eficacia dos anticorpos en experimentos posteriores.