1960 में, द्विविशिष्ट एंटीबॉडी की अवधारणा प्रस्तावित की गई थी। द्विविशिष्ट एंटीबॉडी, जिसे द्विविशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के रूप में भी जाना जाता है, आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीक का उपयोग करके कृत्रिम रूप से संश्लेषित एंटीबॉडी हैं। एक इंजीनियर कृत्रिम एंटीबॉडी के रूप में, द्विविशिष्ट एंटीबॉडी आमतौर पर IgG उपवर्ग से संबंधित होते हैं और इसमें CD3 सबयूनिट को लक्षित करने वाला एक एंटीजन बाइंडिंग टुकड़ा होता है। द्विविशिष्ट एंटीबॉडी में दो विशिष्ट एंटीजन बाइंडिंग साइट होती हैं जो एक साथ दो अलग-अलग एंटीजन या एक एंटीजन के दो अलग-अलग एपिटोप को बांध और पहचान सकती हैं। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की तुलना में, द्विविशिष्ट एंटीबॉडी में एक अतिरिक्त विशिष्ट एंटीजन बाइंडिंग साइट होती है, इस प्रकार इसमें मजबूत विशिष्टता और लक्ष्यीकरण क्षमता होती है, जो ट्यूमर कोशिकाओं को अधिक सटीक रूप से लक्षित कर सकती है और लक्ष्य विषाक्तता को कम कर सकती है। द्विविशिष्ट एंटीबॉडी एक साथ कई जैविक कार्य कर सकते हैं, जैसे कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती करना, सिग्नलिंग मार्ग को अवरुद्ध करना और सीधे ट्यूमर कोशिकाओं को मारना। प्रारंभिक द्विविशिष्ट एंटीबॉडी मुख्य रूप से रासायनिक संयुग्मन या कोशिका संलयन के माध्यम से तैयार किए गए थे, लेकिन यादृच्छिक संयोजन और लक्ष्य संयोजन को अलग करने में कठिनाई के कारण यह विधि धीरे-धीरे आगे बढ़ी होगी। आनुवंशिक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी के निरंतर विकास के साथ, कई नए प्रौद्योगिकी प्लेटफॉर्म विकसित किए गए हैं, जैसे कि नॉट्स इन होल्स (केआईएच), क्रॉसमैब, डीवीडी आईजी, आदि। ये प्लेटफॉर्म भारी श्रृंखला और हल्की श्रृंखला बेमेल जैसी समस्याओं को प्रभावी ढंग से हल करते हैं, और द्विविशिष्ट एंटीबॉडी की एकरूपता और उपज में सुधार करते हैं।

द्विविशिष्ट एंटीबॉडी उत्पादन के लिए मुख्य तरीकों में रासायनिक युग्मन, चार स्रोत हाइब्रिडोमा और आनुवंशिक इंजीनियरिंग एंटीबॉडी तैयारी शामिल हैं। उनमें से, रासायनिक युग्मन विधि दो अक्षुण्ण IgG या दो F (ab ') 2 एंटीबॉडी टुकड़ों को रासायनिक युग्मन एजेंटों जैसे कि फथालिमाइड और डाइथियोएसिलबेन्ज़ोइक एसिड का उपयोग करके द्विविशिष्ट एंटीबॉडी में जोड़ती है। यह विधि सरल और संचालित करने में आसान है, लेकिन यह एंटीजन बाइंडिंग साइट को नुकसान पहुंचा सकती है, एंटीबॉडी गतिविधि को कम कर सकती है, और युग्मन एजेंट में भी एक निश्चित डिग्री कार्सिनोजेनिटी होती है। चार स्रोत हाइब्रिडोमा विधि दो अलग-अलग हाइब्रिडोमा सेल लाइनों से दैहिक कोशिकाओं के संलयन पर आधारित है ताकि संबंधित माउस IgG को व्यक्त किया जा सके। आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीक के माध्यम से, एंटीबॉडी को आनुवंशिक रूप से संशोधित करके द्विविशिष्ट एंटीबॉडी बनाया जा सकता है। दो अलग-अलग मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का निर्माण किया गया, और दो एंटीबॉडी के फैब टुकड़े या भारी श्रृंखला और हल्की श्रृंखला चर क्षेत्रों को अलग-अलग विभाजित किया गया। क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया या चेन पुनर्संयोजन तकनीक के माध्यम से, दो टुकड़ों को एक द्विविशिष्ट एंटीबॉडी बनाने के लिए जोड़ा गया। यद्यपि आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीक की जटिलता अपेक्षाकृत अधिक है, यह वर्तमान में एंटीबॉडी की संरचना और कार्य को समायोजित करने के लिए द्विविशिष्ट एंटीबॉडी उत्पादन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि है। द्विविशिष्ट एंटीबॉडी डिजाइन का संचालन करते समय, एंटीबॉडी क्रॉस रिएक्टिविटी के सिद्धांत का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन एंटीबॉडी क्रॉस रिएक्टिविटी गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकती है, इसलिए इसे द्विविशिष्ट एंटीबॉडी डिजाइन के व्यावहारिक अनुप्रयोग में सावधानी से विचार किया जाएगा, जैसे कि द्विविशिष्ट एंटीबॉडी थेरेपी।

द्विविशिष्ट एंटीबॉडी शुद्धिकरण उच्च शुद्धता वाले लक्ष्य एंटीबॉडी को अलग करने और शुद्ध करने की प्रक्रिया है। कुछ घुलनशील अशुद्धियों को हटाने के लिए दो तरीकों, सेंट्रीफ्यूजेशन और डीप फिल्ट्रेशन का उपयोग किया जाता है। लक्ष्य द्विविशिष्ट एंटीबॉडी को शुरू में एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा कैप्चर किया जाता है। IgG जैसे द्विविशिष्ट एंटीबॉडी के लिए, प्रोटीन A एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी का उपयोग किया जाता है, जबकि गैर IgG जैसे द्विविशिष्ट एंटीबॉडी के लिए, लाइट चेन आधारित एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी का उपयोग किया जा सकता है। इसके बाद, एंटीबॉडी को एक निश्चित अवधि के लिए कम pH स्थितियों के तहत इनक्यूबेट किया जाता है, जिससे वायरस के लिफाफे की सतह पर प्रोटीन संरचना बाधित हो जाती है, जिससे कोशिकाओं को संक्रमित करने की क्षमता खो जाती है। मेजबान कोशिका प्रोटीन (HCP) जैसी अशुद्धियों को और अधिक हटाने के लिए मध्यवर्ती डीप फिल्ट्रेशन किया जाता है। आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी जैसी विधियों के माध्यम से एंटीबॉडी की शुद्धता में सुधार किया जाता है, और किसी भी अवशिष्ट वायरस को नैनोफिल्ट्रेशन या अल्ट्राफिल्ट्रेशन तकनीकों के माध्यम से हटा दिया जाता है। अंत में, नमूने को केंद्रित किया जाता है और एक उपयुक्त फॉर्मूलेशन बफर के साथ बदल दिया जाता है।