Što je inženjerstvo antitijela?

Uz pomoć inženjerstva protutijela, moguće je modificirati veličinu molekule, farmakokinetiku, imunogenost, afinitet vezanja, specifičnost i efektorsku funkciju protutijela. Nakon sintetiziranja protutijela, specifično vezanje protutijela čini ih vrlo vrijednima u kliničkoj dijagnostici i liječenju. Kroz inženjerstvo antitijela, oni mogu zadovoljiti potrebe ranog razvoja lijekova i dijagnostike.

Svrha inženjeringa antitijela je dizajn i proizvodnja visoko specifičnih, stabilnih funkcija koje prirodna antitijela ne mogu postići, postavljajući temelje za proizvodnju terapeutskih antitijela.

Alpha Lifetech, sa svojim opsežnim projektnim iskustvom u inženjeringu antitijela, može pružiti prilagođene usluge monoklonskih i poliklonskih antitijela za više vrsta, kao i izgradnju biblioteke antitijela za prikaz faga i usluge pregleda. Alpha Lifetech može kupcima pružiti kvalitetna bioslična antitijela i rekombinantne proteinske proizvode, kao i odgovarajuće usluge, za proizvodnju učinkovitih, visoko specifičnih i stabilnih antitijela. Koristeći sveobuhvatne platforme za antitijela, proteine ​​i sustave prikaza faga, pružamo usluge koje pokrivaju uzvodno i nizvodno od proizvodnje antitijela, uključujući tehničke usluge kao što su humanizacija antitijela, pročišćavanje antitijela, sekvenciranje antitijela i validacija antitijela.

Pionirska faza inženjeringa antitijela povezana je s dvije tehnologije:

--Tehnologija rekombinantne DNK

--Tehnologija hibridoma

Brzi razvoj inženjeringa protutijela povezan je s tri važne tehnologije:

--Tehnologija kloniranja gena i lančana reakcija polimerazom

-- Ekspresija proteina: rekombinantne proteine ​​proizvode sustavi ekspresije kao što su kvasci, štapićasti virusi i biljke

-- Računalno potpomognuto konstrukcijsko projektiranje

Prva generacija antitijela bila je humanizirana za proizvodnju kimernih antitijela, gdje je varijabilna regija mišjih monoklonskih antitijela bila povezana s konstantnom regijom humanih IgG molekula. Antigen binding region (CDR) mišjeg monoklonskog antitijela druge generacije transplantirano je u ljudski IgG. Osim za CDR regiju, sva druga antitijela su gotovo ljudska antitijela, a uloženi su napori da se izbjegne indukcija odgovora ljudskih anti-mišjih antitijela (HAMA) kada se koriste antitijela mišjih klonova za liječenje ljudi.

 

Za konstruiranje biblioteke fagnog prikaza, prvi korak je dobivanje gena koji kodiraju antitijela, koja se mogu izolirati iz B stanica imuniziranih životinja (konstrukcija imunološke biblioteke), ekstrahirati izravno iz neimuniziranih životinja (konstrukcija prirodne biblioteke), ili čak sastaviti in vitro s fragmentima gena antitijela (konstrukcija sintetičke biblioteke). Zatim se geni umnožavaju PCR-om, ubacuju u plazmide i eksprimiraju u odgovarajućim sustavima domaćina (ekspresija kvasca (obično Pichia pastoris), prokariotska ekspresija (obično E. coli), ekspresija stanica sisavaca, ekspresija biljnih stanica i ekspresija stanica insekata zaraženih virusima u obliku štapića). Najčešći je sustav ekspresije E. coli, koji integrira specifičnu kodirajuću sekvencu antitijela na fag i kodira jedan od proteina ovojnice faga (pIII ili pVIII). Fuzija gena, I prikazana na površini bakteriofaga. Srž ove tehnologije je konstruirati biblioteku prikaza faga, koja ima prednost u odnosu na prirodne biblioteke jer može imati specifično vezanje. Zatim se antitijela sa specifičnošću antigena probiru kroz proces biološke selekcije, ciljni antigeni se fiksiraju, nevezani fagi se više puta ispiru, a vezani fagi se ispiru za daljnje obogaćivanje. Nakon tri ili više ciklusa ponavljanja, izolirana su antitijela visoke specifičnosti i visokog afiniteta.

Slika 3: Konstrukcija i probir knjižnice antitijela

Tehnologija rekombinantne DNA može se koristiti za stvaranje fragmenata antitijela. Fab antitijela se u početku mogu samo hidrolizirati želučanom proteazom kako bi se proizveli (Fab') 2 fragmenti, koje zatim probavlja papain da bi se stvorili pojedinačni Fab fragmenti. Fragment Fv sastoji se od VH i VL, koji imaju lošu stabilnost zbog nepostojanja disulfidnih veza. Stoga su VH i VL zajedno povezani preko kratkog peptida od 15-20 aminokiselina kako bi formirali jednolančani varijabilni fragment (scFv) protutijela s molekularnom težinom od približno 25 KDa.

Proučavanje strukture antitijela kod Camelidae (Camel, LIama i Alpaca) razjasnilo je da antitijela imaju samo teške lance, a ne lake lance, pa se stoga nazivaju antitijelima teškog lanca (hcAb). Varijabilna domena protutijela teškog lanca naziva se jednodomenska protutijela ili nanotijela ili VHH, veličine 12-15 kDa. Kao monomeri, nemaju disulfidne veze i vrlo su stabilni, s vrlo visokim afinitetom za antigene.

Slika 5: Antitijelo teškog lanca i VHH/nanotijelo

Ekspresija bez stanica koristi ekspresiju prirodne ili sintetičke DNA za postizanje in vitro sinteze proteina, obično korištenjem ekspresijskog sustava E. coli. Brzo proizvodi proteine ​​i izbjegava metaboličko i citotoksično opterećenje stanica pri proizvodnji velikih količina rekombinantnih proteina in vivo. Također može proizvesti proteine ​​koje je teško sintetizirati, poput onih koje je teško modificirati nakon translacije ili sintetizirati membranske proteine.