Usluga analize karakterizacije aptamera

Alpha Lifetech već dugi niz godina pruža usluge vezane uz aptamere i trenutno može pružiti sveobuhvatne sheme razvoja aptamera kao što su sinteza aptamera, SELEX probir, visokopropusno sekvenciranje te optimizacija i karakterizacija aptamera. Na temelju prednosti SELEX metode za probir aptamera, Alpha Lifetech je proširio više metoda za probir aptamera.

Uvod u analizu karakterizacije aptamera

Provjera afiniteta

Optimizirani afinitet aptamera provjeren je relevantnim tehnikama testa vezanja aptamera. Primjeri uključuju izotermnu titracijsku kalorimetriju (ITC), protočnu citometriju (FCM) i površinsku plazmonsku rezonancu (SPR), mikrofluidiku itd. Afinitet aptamera obično se izražava konstantom disocijacije (KD), fizičkom veličinom koja se koristi za kvantificiranje stupnja molekularne disocijacije u reverzibilnoj reakciji. Što je manja vrijednost KD, to je kompleks stabilniji, odnosno afinitet je jači; obrnuto, što je veća vrijednost KD, to je kompleks nestabilniji i afinitet slabiji. Ovaj korak je ključan za identifikaciju performansi aptamera, osiguravajući sazrijevanje afiniteta aptamera i mogućnost vezanja na ciljnu molekulu s visokim afinitetom i selektivnošću u praktičnim primjenama.

Sl.1 Proces afinitetnog sazrijevanja aptamera. Izvor reference:Kinghorn AB, Fraser LA, 2017.

Verifikacija funkcije

Uz provjeru afiniteta, potrebno je provjeriti i funkciju aptamera. To uključuje provjeru stabilnosti, specifičnosti i interakcija aptamera s drugim molekulama u određenom okruženju. Rezultati funkcionalne provjere izravno će utjecati na vrijednost aptamera u znanstvenim istraživanjima i industrijskim primjenama.

Specifična provjera

Kompetitivni eksperiment: Sposobnost aptamera da se veže za specifičnu metu procjenjuje se u prisutnosti drugih sličnih meta. Ako se aptamer može specifično vezati za ciljnu molekulu bez interferencije s drugim molekulama, to ukazuje na njegovu visoku specifičnost.

Eksperiment unakrsne reakcije: Aptamer se veže na niz srodnih ili nepovezanih ciljeva kako bi se vidjelo veže li se samo na određeni cilj, te na taj način provjerila njegova specifičnost.

Provjera stabilnosti

Eksperiment razgradnje nukleaza: Aptameri su bili izloženi različitim koncentracijama nukleaza i promatrana je njihova razgradnja. Usporedbom stupnja razgradnje u različitim vremenskim točkama može se procijeniti sposobnost aptamera da razgradi antinukleaze.

Eksperiment temperaturne i vremenske stabilnosti: Aptamer je stavljen pod različite temperaturne i vremenske uvjete kako bi se promatrala njegova strukturna i funkcionalna stabilnost. To pomaže u određivanju optimalnih uvjeta skladištenja i upotrebe aptamera.

Identifikacija biološke aktivnosti

Odgovarajuća metoda se obično odabire prema specifičnom cilju primjene nukleinsko-kiselinskog aptamera.

(1) Testiranje na molekularnoj razini: Korištenje tehnika molekularne biologije, kao što su gel elektroforeza, Western blot itd., za otkrivanje kompleksa nastalih nakon što se aptamer kombinira s ciljnom molekulom ili za otkrivanje promjena u razini ekspresije ciljne molekule uzrokovanih aptamerom.

(2) Testiranje na razini stanica: Korištenjem tehnologije stanične kulture, aptameri se inkubiraju s ciljnim stanicama kako bi se promatrale biološke promjene poput stanične morfologije, proliferacije i apoptoze te procijenila biološka aktivnost aptamera.

(3) Testiranje na životinjskim modelima: U odgovarajućim životinjskim modelima, aptameri nukleinskih kiselina daju se injekcijom ili primjenom lijekova, a fiziološki pokazatelji i patološke promjene životinja promatraju se kako bi se procijenila biološka aktivnost i sigurnost aptamera in vivo.