Služba za razvoj monoklonskih antitijela

Alpha Lifetech Inc.može omogućiti predviđanje epitopa, sintezu peptida, ekspresiju proteina, proizvodnju poliklonskih ili monoklonskih antitijela, kao i pročišćavanje antitijela iz stanične kulture, ascitesa ili cijelog seruma.

Alpha Lifetech Inc.ima iskustva u pružanju raznih usluga stabilnih staničnih linija klijentima, uključujući hibridomske stanice, stanične linije za uređivanje genoma, stanične linije s knockdownom i stanične linije s prekomjernom ekspresijom. Trudimo se ponuditi napredne prilagođene usluge staničnih linija svakom klijentu, a naše usluge su provjerene i pouzdane.

Strategija razvoja antitijela

1. Dizajn i priprema antigena
Ti antigeni mogu biti proteini, peptidi ili druge molekule. Dizajniranje imunogena zahtijeva sveobuhvatan pristup koji integrira znanje o strukturi antigena, imunologiji i sustavima isporuke. Alpha Lifetech ima tehnologiju dizajna antigena koja može dizajnirati imunogene za kupce kojima je to potrebno.
Alpha Lifetech nudi kupcima proizvode rekombinantnih proteina. Imamo razne sustave ekspresije proteina, kao što su sustav ekspresije E. coli, sustav ekspresije kvasca, sustav ekspresije bakulovirusa i insekata, sustav ekspresije sisavaca itd., za proizvodnju rekombinantnih proteina potrebnih za istraživanje.

2. Imunizacija životinja
Alpha Lifetech može kupcima osigurati imunogene, a na raspolaganju su vam imune životinje poput miševa, zečeva, ovaca, alpaka, zamoraca, hrčaka itd.

3. Metode proizvodnje monoklonskih antitijela

●Proizvodnja Mab hibridomskom tehnologijom
Hibridom je hibridna stanica nastala fuzijom dviju vrsta stanica, naime stanične linije mišjeg mijeloma i plazma stanica (limfocit B), u kojoj heterozigotna stanica može kontinuirano proizvoditi antitijela protiv antigena od interesa in vitro. Proizvodnja hibridomske stanične linije sastoji se od tri dijela: dizajna antigena (hapteni, male molekule i peptidi), imunizacije životinja, stanične fuzije i probira pozitivnih klonova. Korištenjem jedinstvenih metodologija imunizacije postižemo iznimno visoku učinkovitost stanične fuzije (1-10 hibridoma na tisuću B stanica) i visoke titre antitijela, maksimizirajući našu stopu uspjeha u kasnijim analitičkim testovima koji uključuju biokemijski probir, in vitro testove na stanicama i studije na životinjama.

●Proizvodnja monoklonskih antitijela tehnologijom prikaza faga
Fagni prikaz nudi još jednu metodu za generiranje monoklonskih antitijela. B-limfociti se izoliraju iz životinjske krvi i ekstrahira se njihova mRNA. Pomoću PCR-a, ova mRNA se pretvara u cDNA, koja amplificira sve VH i VL segmente. Ovi segmenti se zatim kloniraju u vektor, obično kao jednolančani varijabilni fragmenti (scFv), uz PIII protein bakteriofaga. Nakon toga, ova konstrukcija se koristi za infekciju E. coli, što rezultira stvaranjem biblioteke koja sadrži približno 10^10 stanica putem inokulacije fagom pomoćnikom. E. coli tada može lučiti bakteriofag koji sadrži VH i VL segmente kao dio svoje ovojnice. Nakon toga, specifični VH i VL segmenti koji ciljaju antigen od interesa mogu se odabrati i koristiti za reinokulaciju E. coli bakteriofagom. Stanice koje sadrže plazmid se zatim izoliraju i sekvenciraju.

4. Probir fuzije

●Fuzija i selekcija stanica
Prikupljene B stanice se zatim spajaju sa stanicama mijeloma, koje su kancerogene stanice koje se mogu neograničeno razmnožavati u kulturi. Fuzija se obično postiže tehnikom kao što je fuzija polietilen glikola (PEG).
Nakon fuzije, hibridomske stanice se uzgajaju u selektivnom mediju koji omogućuje preživljavanje samo hibridomima. Medij obično sadrži aminopterin, koji sprječava rast nefuziranih mijelomskih stanica.

●Probir i kloniranje
Dobivene hibridomske stanice se pregledavaju na proizvodnju antitijela specifičnih za ciljni antigen. To se obično radi tehnikama kao što su enzimski imunosorbentni test (ELISA), Western blot, imunoprecipitacija i protočna citometrija.

Nakon što se identificiraju hibridomske stanice koje proizvode antitijelo, one se kloniraju kako bi se stvorila populacija identičnih stanica. To osigurava da je antitijelo koje proizvodi svaka hibridomska stanica identično.

5. Verifikacija funkcionalnosti antitijela
Alpha Lifetech pruža funkcionalnu validaciju antitijela, kao što su Western blotting, imunohistokemija ili funkcionalni testovi, za karakterizaciju monoklonskih antitijela i potvrdu specifičnosti, afiniteta i funkcionalnosti antitijela.

6. Optimizacija antitijela
Pročišćavanje antitijela iz supernatanta kulture korištenjem tehnika kao što je afinitetna kromatografija proteina A ili proteina G, a Alpha Lifetech također može pružiti metode modifikacije antitijela za poboljšanje afiniteta antitijela.

7. Proizvodnja antitijela
Alpha Lifetech može procijeniti kandidatska antitijela za visokoučinkovite probirne primjene i proizvodnju velikih razmjera.

često postavljana pitanjačesto postavljana pitanja

Često postavljana pitanja o razvoju monoklonskih antitijela

1

Kako odabrati pravi fuzijski hibridom?

Tijekom procesa fuzije, 10-15 mikrotitarskih ploča s 96 jažica zasijava se smjesom fuzijskog hibrida. Svaka ploča se hrani HAT-IMDM selekcijskim medijem i drži u inkubatoru s ugljikovim dioksidom na 37 stupnjeva Celzija. 9-14 dana nakon fuzije, hibridni supernatanti se testiraju na prisutnost specifičnog antitijela od interesa.
2

Kako poboljšati učinkovitost selekcije?

Fuzija plazma stanica s njihovim mijelomskim ekvivalentima nije 100% učinkovita. Čak i pod optimalnim uvjetima i najučinkovitijom stimulacijom, fuzija stanica i dalje proizvodi mješavinu nekonfluentnih i konfluentnih stanica koje je potrebno odvojiti. Kako bi se poboljšala učinkovitost procesa selekcije, mijelomskim stanicama korištenim za fuziju nedostaje HGPRT, ključni enzim u putu spašavanja nukleotida. Smjesa je zatim uzgajana u HAT mediju, gdje su bile održive samo stanice s enzimom HGPRT, hibridomi koji su naslijedili HGPRT od plazma stanica.
3

Kako provjeriti aktivnost antitijela u hibridomskim staničnim linijama?

Evaluacija hibridnih sorti ključan je korak. Obično se probir supernatanta hibridoma, klonova i subklonova provodi putem enzimsko-imunosorbentnog testa (ELISA), Western blot testa i sortiranja stanica aktiviranih fluorescentnom aktivacijom (FACS). Odlužit ćemo se provesti sav probir supernatanta u vlastitom laboratoriju.
4

Navedite detaljne upute o tome kako provesti probir aktivnosti antitijela?

Hibridomski supernati koji će se testirati mogu se kretati od 500 do 1440 uzoraka i bit će spremni za testiranje od 9. do 14. dana. Možemo nastati u razdoblju od tri do pet dana ili svi možemo biti spremni istog dana, stoga je važno da klijentski laboratorij bude pripremljen tjednima unaprijed s radnim specifičnim sekundarnim probirnim testovima po izboru.
5

Zašto je potrebno subklonirati pozitivne hibridome?

Nakon što su pozitivni rezultati identificirani tijekom početnog ELISA postupka probira, hibridomi su preneseni u veći volumen, tj. ploče s 24 jažice, u pripremi za postupak subkloniranja. Subkloniranje hibridoma obično se provodi metodom ograničenog razrjeđivanja kako bi se osigurala izolacija stabilnih monoklonova. Tehnika uključuje razrjeđivanje hibridomskih kultura i njihovo raspršivanje u ploče s 96 jažica kako bi se postigla monoklonalnost (jedna stanica po jažici). Treba provesti najmanje dva ograničena razrjeđenja kako bi se smanjio rizik od razvoja miješanih populacija hibridoma.
6

Koje su prednosti korištenja hibridomske tehnologije za otkrivanje antitijela?

Hibridne stanične linije hvaljene su zbog svoje sposobnosti proizvodnje antitijela s visokim afinitetom, stabilnošću i specifičnošću na najisplativiji način.