Mi az antitest-tervezés?

Az antitest-tervezés segítségével lehetővé vált az antitestek molekulaméretének, farmakokinetikájának, immunogenitásának, kötődési affinitásának, specificitásának és effektorfunkciójának módosítása. Az antitestek szintetizálása után a specifikus kötődés rendkívül értékessé teszi őket a klinikai diagnózisban és kezelésben. Az antitest-tervezés révén kielégíthetik a gyógyszer- és diagnosztikai korai fejlesztés igényeit.

Az antitest-tervezés célja olyan, rendkívül specifikus, stabil funkciók megtervezése és előállítása, amelyeket a természetes antitestek nem tudnak elérni, lerakva ezzel az alapokat a terápiás antitestek előállításához.

Az Alpha Lifetech, az antitest-tervezés területén szerzett széleskörű projekttapasztalatával, testreszabott monoklonális és poliklonális antitest szolgáltatásokat kínál több faj esetében, valamint fág-megjelenítő antitestkönyvtár-építési és szűrési szolgáltatásokat. Az Alpha Lifetech minőségi bioszimiláris antitesteket és rekombináns fehérjetermékeket, valamint kapcsolódó szolgáltatásokat nyújt ügyfeleinek hatékony, nagy specifikusságú és stabil antitestek előállításához. Átfogó antitest-, fehérjeplatformok és fág-megjelenítő rendszerek alkalmazásával szolgáltatásokat nyújtunk az antitest-termelés upstream és downstream szakaszaiban, beleértve az olyan technikai szolgáltatásokat, mint az antitest-humanizáció, az antitest-tisztítás, az antitest-szekvenálás és az antitest-validálás.

Az antitest-tervezés úttörő szakasza két technológiához kapcsolódik:

--Rekombináns DNS-technológia

--Hibridóma technológia

Az antitest-tervezés gyors fejlődése három fontos technológiához kapcsolódik:

--Génklónozási technológia és polimeráz láncreakció

--Fehérjeexpresszió: A rekombináns fehérjéket olyan expressziós rendszerek termelik, mint az élesztő, pálcika alakú vírusok és növények.

--Számítógéppel segített szerkezeti tervezés

Az első generációs antitesteket humanizálták kiméra antitestek előállításához, ahol az egér monoklonális antitestek variábilis régióját az emberi IgG molekulák konstans régiójához kapcsolták. A második generációs egér monoklonális antitest antigénkötő régióját (CDR) humán IgG-be transzplantálták. A CDR régió kivételével az összes többi antitest szinte emberi antitest, és erőfeszítéseket tettek annak érdekében, hogy elkerüljék az emberi anti-egér antitest (HAMA) válaszreakciók kiváltását, amikor egér klón antitesteket alkalmaztak emberi kezelésre.

 

Egy fágmegjelenítő könyvtár létrehozásához az első lépés az antitesteket kódoló gének kinyerése, amelyek izolálhatók immunizált állatok B-sejtjeiből (immunkönyvtár-készítés), közvetlenül kivonhatók nem immunizált állatokból (természetes könyvtár-készítés), vagy akár in vitro összeállíthatók antitest génfragmensekkel (szintetikus könyvtár-készítés). Ezután a géneket PCR-rel amplifikálják, plazmidokba inszertálják, és megfelelő gazdarendszerekben expresszálják (élesztő expresszió (általában Pichia pastoris), prokarióta expresszió (általában E. coli), emlőssejt-expresszió, növénysejt-expresszió és pálcika alakú vírusokkal fertőzött rovarsejt-expresszió). A leggyakoribb az E. coli expressziós rendszer, amely egy specifikus kódoló antitest-szekvenciát integrál a fágra, és a fághéjfehérjék egyikét (pIII vagy pVIII) kódolja. A génfúzió a bakteriofágok felületén jelenik meg. Ennek a technológiának a lényege egy fágmegjelenítő könyvtár létrehozása, amelynek az az előnye a természetes könyvtárakkal szemben, hogy specifikus kötődésre képes. Ezt követően az antigénspecificitású antitesteket biológiai szelekciós folyamaton keresztül szűrik, a célantigéneket fixálják, a nem kötődött fágokat ismételten lemossák, majd a kötött fágokat lemossák további dúsítás céljából. Három vagy több ismétlési kör után nagy specificitású és nagy affinitású antitesteket izolálnak.

3. ábra: Antitestkönyvtár létrehozása és szűrése

Rekombináns DNS-technológia alkalmazható antitestfragmensek előállítására. A Fab antitesteket kezdetben csak gyomorproteáz képes hidrolizálni (Fab ')2 fragmensek előállítására, amelyeket aztán papain emészt meg, így egyedi Fab fragmensek keletkeznek. Az Fv fragmens VH-ból és VL-ből áll, amelyek a diszulfidkötések hiánya miatt gyenge stabilitással rendelkeznek. Ezért a VH és a VL egy rövid, 15-20 aminosavból álló peptiden keresztül kapcsolódik össze, így egy körülbelül 25 kDa molekulatömegű, egyláncú variábilis fragmens (scFv) antitestet alkotva.

A tevefélék (teve, liama és alpaka) antitest-szerkezetének vizsgálata kimutatta, hogy az antitestek csak nehézláncokkal rendelkeznek, könnyűláncok nélkül, ezért nehézlánc-antitesteknek (hcAb) nevezik őket. A nehézlánc-antitestek variábilis doménjét egydoménes antitesteknek vagy nanotesteknek vagy VHH-nak nevezik, méretük 12-15 kDa. Monomerként nincsenek diszulfidkötéseik, és nagyon stabilak, nagyon nagy affinitással az antigének iránt.

5. ábra: Nehézlánc-antitest és VHH/Nanotest

A sejtmentes expresszió természetes vagy szintetikus DNS expresszióját használja fel az in vitro fehérjeszintézis eléréséhez, jellemzően az E. coli expressziós rendszer használatával. Gyorsan termel fehérjéket, és elkerüli a sejtek metabolikus és citotoxikus terhelését, amikor nagy mennyiségű rekombináns fehérjét állít elő in vivo. Nehéz szintetizálható fehérjéket is képes előállítani, például azokat, amelyeket nehéz módosítani a transzláció után, vagy membránfehérjéket szintetizálni.