Mi az az antitestfejlesztés?

Az antitest-manipuláció segítségével lehetővé vált az antitestek molekulaméretének, farmakokinetikájának, immunogenitásának, kötési affinitásának, specificitásának és effektor funkciójának módosítása. Az antitestek szintetizálása után az antitestek specifikus kötődése rendkívül értékessé teszi őket a klinikai diagnózisban és kezelésben. Az antitestfejlesztés révén kielégíthetik a korai gyógyszer- és diagnosztikai fejlesztés igényeit.

Az antitest-mérnökség célja olyan rendkívül specifikus, stabil funkciók tervezése és előállítása, amelyeket a természetes antitestek nem képesek elérni, megalapozva ezzel a terápiás antitestek termelését.

Az Alpha Lifetech, amely kiterjedt projekttapasztalattal rendelkezik az antitestfejlesztés terén, testreszabott monoklonális és poliklonális antitest-szolgáltatásokat tud nyújtani több faj számára, valamint fágmegjelenítési antitestkönyvtár-építési és szűrési szolgáltatásokat. Az Alpha Lifetech minőségi biohasonló antitesteket és rekombináns fehérjetermékeket, valamint megfelelő szolgáltatásokat tud nyújtani ügyfelei számára hatékony, nagyon specifikus és stabil antitestek előállításához. Átfogó antitest-, fehérje-platformok és fágmegjelenítő rendszerek használatával szolgáltatásokat nyújtunk az antitest-termelés előtti és utáni szakaszában, beleértve az olyan technikai szolgáltatásokat, mint az antitest-humanizálás, az antitest-tisztítás, az antitest-szekvenálás és az antitest-validáció.

Az antitestfejlesztés úttörő szakasza két technológiához kapcsolódik:

-- Rekombináns DNS technológia

- Hibridóma technológia

Az antitestfejlesztés gyors fejlődése három fontos technológiához kapcsolódik:

--Gén klónozási technológia és polimeráz láncreakció

- Fehérjeexpresszió: A rekombináns fehérjéket expressziós rendszerek, például élesztőgombák, rúd alakú vírusok és növények termelik

- Számítógéppel segített szerkezeti tervezés

Az antitestek első generációját humanizálták kiméra antitestek előállítására, ahol az egér monoklonális antitestek variábilis régióját a humán IgG molekulák konstans régiójához kapcsolták. A második generációs egér monoklonális antitest antigénkötő régióját (CDR) humán IgG-be ültettük át. A CDR-régió kivételével az összes többi antitest csaknem humán antitest, és erőfeszítéseket tettek arra, hogy elkerüljék a humán anti-egér antitest (HAMA) válaszok kiváltását, amikor egér klón antitesteket használnak humán kezelésre.

 

A fágmegjelenítő könyvtár felépítéséhez az első lépés az antitesteket kódoló gének előállítása, amelyek izolálhatók immunizált állatok B-sejtjéből (immunkönyvtár készítés), közvetlenül nem immunizált állatokból extrahálhatók (természetes könyvtárépítés), vagy akár in vitro összeállíthatók antitest génfragmensekkel (szintetikus könyvtár készítés). Ezután a géneket PCR-rel amplifikálják, plazmidokba inszertálják, és megfelelő gazdarendszerekben expresszálják (élesztő expresszió (általában Pichia pastoris), prokarióta expresszió (általában E. coli), emlős sejtexpresszió, növényi sejtexpresszió és rúd alakú vírusokkal fertőzött rovarsejt expresszió). A legelterjedtebb az E. coli expressziós rendszer, amely egy specifikus kódoló antitest-szekvenciát integrál a fágba, és a fághéj egyik fehérjét (pIII vagy pVIII) kódolja. A génfúzió, és megjelenik a bakteriofágok felszínén. Ennek a technológiának a lényege egy fágmegjelenítési könyvtár létrehozása, amelynek előnye a természetes könyvtárakkal szemben, hogy specifikusan köthető. Ezt követően az antigénspecifitású antitesteket biológiai szelekciós eljárással átvizsgálják, a célantigéneket rögzítik, a meg nem kötött fágokat ismételten lemossák, a megkötött fágokat pedig lemossák a további dúsítás érdekében. Három vagy több ismétlési kör után nagy specificitású és nagy affinitású antitesteket izolálunk.

3. ábra: Antitestkönyvtár felépítése és szűrése

A rekombináns DNS technológia használható antitestfragmensek előállítására. A Fab antitesteket kezdetben csak gyomorproteáz hidrolizálja (Fab') 2 fragmensek előállítására, amelyeket azután papain emészt, hogy egyedi Fab fragmentumokat hozzon létre. Az Fv fragmens VH-ból és VL-ből áll, amelyek a diszulfid kötések hiánya miatt gyenge stabilitásúak. Ezért a VH és a VL egy 15-20 aminosavból álló rövid peptiden keresztül kapcsolódnak egymáshoz, és körülbelül 25 kDa molekulatömegű egyláncú variábilis fragmens (scFv) antitestet képeznek.

A Camelidae (Camel, LIama és Alpaca) antitestszerkezetének vizsgálata rávilágított arra, hogy az antitesteknek csak nehéz láncai vannak, könnyű láncaik nincsenek, ezért nehéz lánc antitesteknek (hcAb) nevezik őket. A nehézlánc antitestek variábilis doménjét egydoménes antitesteknek vagy nanotesteknek vagy VHH-nak nevezik, mérete 12-15 kDa. Monomerként nincsenek diszulfidkötéseik, és nagyon stabilak, és nagyon nagy affinitással rendelkeznek az antigénekhez.

5. ábra: Nehézláncú antitest és VHH/nanobody

A sejtmentes expresszió a természetes vagy szintetikus DNS expresszióját használja fel az in vitro fehérjeszintézis eléréséhez, jellemzően az E. coli expressziós rendszer használatával. Gyorsan termel fehérjéket, és elkerüli a sejtek metabolikus és citotoxikus terhelését, amikor nagy mennyiségű rekombináns fehérjét termelnek in vivo. Nehezen szintetizálható fehérjéket is tud termelni, például olyanokat, amelyek transzláció után nehezen módosíthatók vagy membránfehérjéket szintetizálnak.