Platform Pengukuran Afinitas
Berdasarkan platform Octet dan Biacore-T2000, Alpha Lifetech dapat menyediakan layanan penentuan afinitas yang andal.
HUBUNGI KAMI01
Platform Pengukuran Afinitas
Berdasarkan platform Octet dan Biacore-T2000, Alpha Lifetech dapat menyediakan layanan penentuan afinitas yang andal. Kami dapat menyediakan penentuan afinitas untuk beberapa sampel, seperti antibodi, sel, protein, molekul kecil, dll. Ada berbagai metode penentuan afinitas, termasuk penentuan afinitas resonansi plasmon permukaan (SPR) dan interferensi bio-layer (BLI).
Alpha Lifetech memiliki platform penentuan afinitas yang profesional dan akurat yang menggabungkan ELISA dengan penentuan afinitas, memberikan hasil penentuan afinitas yang profesional, efisien, cepat, dan tepat bagi pelanggan di seluruh dunia. Kami dapat menawarkan dua metode bagi pelanggan untuk dipilih: Penentuan Afinitas Cepat dan Penentuan Afinitas Tepat. Penentuan afinitas cepat adalah penentuan konsentrasi tunggal, sedangkan penentuan afinitas tepat dapat mengukur afinitas berbagai konsentrasi. Diterapkan pada studi interaksi antara berbagai senyawa molekul kecil, peptida, protein, oligonukleotida, dan oligomer, serta lipid, bakteriofag, virus, dan sel. Platform pengukuran afinitas dapat menjadi dasar untuk pengujian dan penyaringan obat afinitas, penemuan antibodi, dan memfasilitasi penelitian selanjutnya.
Pengantar Afinitas Pengikatan
Afinitas penting dalam mengevaluasi interaksi antarmolekul, uji afinitas obat, dan penyaringan obat. Interaksi antarmolekul dapat dijelaskan dengan persamaan: L + R = LR, di mana L mewakili ligan bebas, R mewakili reseptor tak terikat, dan LR mewakili kompleks ligan-reseptor terikat. Reaksi pengikatan mendefinisikan interaksi antarmolekul, di mana pertukaran dinamis terjadi antara keadaan terikat dan tak terikat selama reaksi hingga kesetimbangan tercapai. Hal ini dapat dijelaskan oleh dua konstanta laju, Kon (konstanta laju pengikatan) dan Koff (konstanta laju disosiasi), dari reaksi tersebut. Nilai Kd, yang merupakan kebalikan dari konstanta pengikatan (Ka), adalah Koff/Kon, konstanta penting untuk afinitas reaksi. Oleh karena itu, semakin erat ikatan antara dua molekul, semakin tinggi afinitasnya. Semakin kecil nilai Kd, sebaliknya. Persamaan ini dapat direpresentasikan sebagai kurva berbentuk S pada grafik semi-logaritmik, dengan konsentrasi ligan pada sumbu x (pada sumbu skala logaritmik) dan batas fraksional pada sumbu y. Garis putus-putus merepresentasikan konsentrasi ligan pada Kd (1 nM) sebesar 0,5 fraksi pengikatan.
Gambar 1: Kurva pengikatan sigmoidal dari berbagai konsentrasi ligan yang terikat pada reseptor permukaan sel. (Sumber referensi:Hunter SA, Cochran JR. Uji Pengikatan Sel untuk Menentukan Afinitas Interaksi Protein-Protein: Teknologi dan Pertimbangan.)
Metode untuk Menentukan Afinitas
Uji afinitas pengikatan ELISA
Teknik yang banyak digunakan untuk mempelajari afinitas antibodi didasarkan pada metode ELISA, yang dicirikan oleh kemudahan, kecepatan, kesederhanaan, sensitivitas tinggi, dan spesifisitas yang kuat. Metode ini dapat menggunakan sejumlah kecil reagen (yaitu, antibodi dan antigen) dan mengukur afinitas antibodi tanpa memerlukan reagen pemurnian. Dengan melumpuhkan antigen pada permukaan padat dan mendeteksinya menggunakan antibodi primer, antibodi sekunder berlabel bereaksi dengan antibodi primer untuk membaca dan menganalisis data dalam pembaca enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Gambar 2: Pengujian seperti ELISA untuk mengevaluasi pengikatan peptida yang dirancang dengan targetnya. (Sumber referensi:Hajikarimlou, Maryam, dkk., 2022. Pendekatan komputasional untuk merancang peptida secara cepat yang mendeteksi protein permukaan SARS-CoV-2 S.)
Uji afinitas pengikatan Surface Plasmon Resonance (SPR)
Teknologi SPR terutama mendeteksi perubahan indeks bias. Dengan bantuan fenomena optik tradisional dan fenomena resonansi cahaya, teknologi analisis biosensing untuk interaksi antara biomolekul dapat dibangun untuk mendeteksi interaksi antara ligan dan analit pada chip biosensing. Sinyal spesifik pengikatan dan interaksi antara biomolekul dapat diperoleh dengan memantau perubahan dinamis pada sudut SPR selama reaksi biologis.
Gambar 3: Analisis resonansi plasmon permukaan (SPR) dari pengikatan H10/AGR2. (Sumber referensi:Garri, Carolina, dkk., 2018. Identifikasi, karakterisasi, dan penerapan peptida baru terhadap homolog gradien anterior 2 (AGR2).)
Uji afinitas pengikatan Bio Layer Interference (BLI)
Teknologi interferensi biofilm adalah teknik deteksi optik pemantauan waktu nyata tanpa label yang terutama digunakan untuk analisis kuantitatif komprehensif tentang interaksi antarmolekul dan penentuan konsentrasi protein. Teknologi ini menggunakan biosensor berbasis probe untuk secara langsung mendeteksi perubahan ketebalan biofilm pada sampel. Dengan mendeteksi perubahan perpindahan spektrum interferensi, pengikatan dan disosiasi antara biomolekul yang berinteraksi pada permukaan sensor dideteksi, dan perpindahan waktu nyata (nm) dari spektrum interferensi ditampilkan.
Gambar 4: Uji interferometri biolayer (BLI) antara aLDRG dan kitinoligosakarida. (Sumber referensi:Li, Bing, 2023. Ciri-ciri Transkriptom Komparatif antara Rizomorf dan Hifa Armillaria sp. 541 yang Berpartisipasi dalam Simbiosis Jamur dengan Penekanan pada Domain LysM.)
Perbandingan Teknologi BLI dan SPR
| Nama Teknologi | BLI (Interferometri Lapisan Bio) | SPR (Resonansi Plasmon Permukaan) |
|---|---|---|
| Prinsip | Mengukur perubahan pola interferensi cahaya pantulan pada permukaan sensor, mendeteksi interaksi molekuler melalui perubahan ketebalan optik pada lapisan biologis. Menyediakan kurva pengikatan waktu nyata (pengukuran langsung). | Mengukur interaksi molekuler dengan mendeteksi perubahan sinyal pada indeks bias di dekat permukaan chip sensor (terjadi saat cahaya berinteraksi dengan antarmuka emas dan kaca, yang menyebabkan perubahan pada indeks bias). Data tercermin sebagai perubahan pada sudut resonansi (pengukuran tidak langsung). |
| Pabrikan | Penjahit | GE |
| Instrumen | Biosensor ForteBio | Instrumen SPR Terbuka |
| Sistem | Sistem Oktet ForteBio (untuk analisis interaksi molekuler) | TraceDrawer (dikembangkan oleh Ridgeview Instruments, Swedia) |
| Keuntungan | 1. Kompatibilitas sampel yang luas, stabilitas yang sangat baik, terutama untuk mendeteksi molekul kecil (persyaratan khusus untuk kemurnian sampel dan kondisi penyangga tidak terlalu ketat). Chip SSA hemat biaya untuk studi pengikatan. 2. Throughput lebih cepat dan waktu eksperimen lebih singkat dibandingkan dengan SPR. | 1. Sejarah pengembangan yang lebih panjang, menawarkan sensitivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan BLI. 2. Presisi dan ketahanan yang lebih tinggi untuk aplikasi spesifik, seperti mendeteksi protein langka atau berharga dengan data afinitas dan spesifisitas yang lebih tinggi. |
| Kekurangan | 1. Presisi data sedikit lebih rendah dibandingkan dengan SPR. 2. Memerlukan pemeliharaan instrumen secara cermat. 3. Biaya chip SSA relatif tinggi. | 1. Kondisi penyangga untuk mendeteksi molekul yang sangat kecil dapat sangat menantang, sehingga meningkatkan risiko kegagalan deteksi. 2. Chip pada umumnya lebih mahal daripada yang digunakan di BLI. 3. Penguapan sampel selama percobaan yang diperpanjang dapat menjadi masalah. |
| Jenis Chip | Chip SSA | Chip NTA |
Ruang Lingkup Pengukuran Afinitas
Penentuan afinitas dapat mencakup antigen-antibodi (antigen-antibodi kuat, antigen-antibodi lemah), protein-protein, protein-peptida, protein-molekul kecil, dan protein DNA/RNA (aptamer). Saat mengukur KD, perlu diketahui salah satu konsentrasi molar. Saat molekul kecil berikatan, satu berat molekul tidak boleh kurang dari 150 dalton.
| Jenis | Cakupan | Tindakan pencegahan |
|---|---|---|
| 1. Antigen-Antibodi | 10^-6 hingga 10^-12 | Nilai Kd dari sebagian besar antibodi berada dalam kisaran 10^-6-10^-7 hingga 10^-9. Secara umum diyakini bahwa antibodi afinitas tinggi berada dalam kisaran 10^-9, sedangkan antibodi afinitas tinggi berada dalam kisaran 10^-12. |
| 2. Protein - Molekul Kecil | 10^-4 hingga 10^-5 | KD molekul kecil dan protein berada di antara 10^-4 dan 10^-5, sedangkan 10^-3 dan 10^-7 adalah normal dan tidak dapat mencapai 10^-10. Molekul kecil kovalen dapat mencapai 10^-10. |
| 3. Avidin Biotin | 10^-14 | Afinitas dapat dengan mudah menjalani pengikatan non-spesifik, dan streptavidin atau afinitas deglikosilasi dapat digunakan. |
| 4. DNA-Protein | 10^-8 hingga 10^-10 | DNA berkualitas tinggi dan lengkap; hati-hati untuk mencegah pengaruh elektroforesis. |
Persyaratan contoh untuk penentuan afinitas
| Mencicipi | Persyaratan |
|---|---|
| 1. Sampel Molekul Besar | Protein > 50 µg, antibodi > 100 µg, protein terbiotinilasi > 200 µg; protein tanpa biotin > 2 mg, persyaratan kemurnian > 90%, larutan penyangga: PBS, HEPBS. Tidak boleh mengandung gugus imidazol; diperlukan kontrol kualitas. |
| 2. Sampel Molekul Kecil | Kuantitas>1mg, bubuk atau cairan, cairan harus larut dalam air atau DMSO. Usahakan tidak mengandung gliserol, imidazol, trehalosa atau garam lainnya; usahakan untuk menghindari reagen dengan gugus amino seperti Tris dalam buffer, umumnya PBS, HEPPS, dll. tanpa reagen organik. |
Analisis beberapa sampel
Alpha Lifetech dapat menyediakan uji afinitas untuk berbagai sampel, termasuk antibodi, sel, protein, dan biomolekul lainnya.
Platform teknologi yang matang
Kami memiliki teknologi canggih seperti uji pengikatan spr, uji pengikatan bli, dan uji pengikatan elisa.
Pemilihan proyek yang fleksibel
Pelanggan dapat memilih antara penentuan afinitas cepat dan penentuan afinitas tepat.
Hasil presisi tinggi
Tim teknis profesional kami dapat memastikan hasil penentuan afinitas yang efisien, akurat, dan dapat diandalkan.
Studi KasusKASUS
Antibodi uji afinitas cepat BLI dan uji afinitas aptamer
Tangkap aptamer yang terbiotinilasi dengan spesifisitas probe SA dan larutkan. Larutkan dan encerkan sampel hingga konsentrasi tetap, padatkan aptamer Target 1-5 yang ditangkap secara spesifik oleh probe, dan setelah sinyal jenuh, ikat ke sampel. Kemudian tambahkan ke pelat 96-well.
Gambar 5: Distribusi posisi deteksi untuk sampel pelat 96-sumur. B merujuk pada buffer yang digunakan untuk menyeimbangkan dan memisahkan sensor. L: Target Biotin 1-5 aptamer, 221: Sampel.
Perhatikan pengeboran untuk memastikan stabilitas dan keakuratan data, dan atur program yang sesuai untuk mendapatkan hasil:
Gbr. 6: Diagram interaksi yang sesuai antara aptamer Target 1, 2, dan 3 dan sampel. (CH 1 \ 3 \ 5 menunjukkan sinyal dan data interaksi antara probe aptamer Target 1 \ 2 \ 3 yang telah dipadatkan dan sampel.)
Gbr. 7: Diagram interaksi antara aptamer Target 4 dan 5 dan sampel. (CH 1 \ 3 menunjukkan sinyal dan data interaksi antara probe aptamer Target 4 \ 5 yang telah dipadatkan dan sampel.)
hasil menunjukkan
Hasil berikut diperoleh: Afinitas adaptor Target 1 terhadap sampel setelah pemasangan adalah 9,41 ^ -8; afinitas adaptor Target 2 terhadap sampel setelah pemasangan adalah 8,32 ^ -8; afinitas adaptor Target 3 terhadap sampel setelah pemasangan adalah 8,64 ^ -8; afinitas adaptor Target 4 terhadap sampel setelah pemasangan adalah 3,70 ^ -8; afinitas adaptor Target 5 terhadap sampel setelah pemasangan adalah 3,01 ^ -8.
Jika Anda memiliki pertanyaan, jangan ragu untuk menghubungi kami kapan saja.
Leave Your Message
Tanggal 16 Juli 2018 
01tanggal 02