Teknologi phage display adalah memasukkan gen target asing ke posisi spesifik protein kapsid fage, dan mengekspresikan gen asing tersebut di permukaan fage tanpa memengaruhi fungsi normal fage. Setelah beberapa putaran penyaringan, protein target dengan spesifisitas yang kuat dan aktivitas biologis yang tinggi akhirnya diperoleh.

Dengan menggunakan teknologi ini, pustaka antibodi berkapasitas tinggi dapat dihasilkan. Siklus penyaringannya singkat, proses operasionalnya mudah, dan jangkauan aplikasinya luas, memungkinkan identifikasi sekuens optimal untuk peptida atau protein target. Dalam aplikasi yang berkaitan dengan virus, peneliti dapat menemukan antibodi yang mengikat epitop virus kritis dengan menyaring pustaka antibodi yang besar. Proses ini dapat menghambat mekanisme masuk, replikasi, atau penghindaran kekebalan virus, sehingga membangun dasar untuk pengobatan penyakit.

Teknologi tampilan fage (phage display) lebih banyak digunakan daripada teknologi hibridoma, yang terbatas pada produksi sejumlah kecil antibodi terhadap imunogen spesifik. Sebaliknya, teknologi tampilan fage dapat menampilkan seluruh pustaka antibodi yang berasal dari berbagai spesies imun.

Teknologi tampilan fage memiliki berbagai macam aplikasi, termasuk penyaringan reseptor mikroorganisme patogen, mempelajari interaksi protein, melacak transmisi sinyal antar sel, mendiagnosis penyakit hewan, dan mengembangkan vaksin, di antara bidang-bidang lainnya.

Teknologi tampilan fage menawarkan banyak keuntungan dan dapat diterapkan di berbagai bidang. Namun, tantangan utama dalam mengembangkan antibodi rekombinan menggunakan metode tampilan fage adalah kompleksitas dan biaya yang terkait dengan proses tersebut. Pendekatan ini memerlukan integrasi teknik biologi molekuler, termasuk mutasi, kloning, dan ekspresi, bersama dengan analisis imunologi, biokimia, dan biofisika untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi antibodi yang diinginkan.

Presentasi antigen merupakan mata rantai yang sangat penting. Metode presentasi antigen terutama meliputi presentasi antigen berlapis langsung, presentasi antigen berlapis tidak langsung, presentasi antigen melalui penyaringan sel utuh, presentasi antigen melalui liposom, cakram nano-fosfolipid, dan VLP.

Metode pelapisan langsung relatif sederhana, tetapi konformasi antigen mudah berubah, dan operasi pelapisan tidak langsung rumit, tetapi dapat mempertahankan konformasi antigen dan meningkatkan efisiensi presentasi. Penyaringan sel dapat mensimulasikan skenario nyata in vivo, tetapi ada masalah pengikatan nonspesifik. Cakram nano-fosfolipid memiliki ukuran kecil, efisiensi pengiriman tinggi, dan stabilitas yang baik; VLP menyatu dengan antigen atau dibungkus dengan antigen, yang memiliki imunogenisitas tinggi dan keamanan yang baik, serta dapat memicu respons imun yang kuat.

Jika konsentrasinya terlalu rendah, kemungkinan pengikatan dengan fage akan menurun, sehingga mengurangi efisiensi penyaringan. Sebaliknya, konsentrasi yang terlalu tinggi dapat meningkatkan kemungkinan pengikatan nonspesifik, meningkatkan sinyal latar belakang, dan menghambat identifikasi klon positif.

Metode fiksasi ringan dapat diadopsi untuk menghindari suhu tinggi, asam kuat, dan basa kuat. Metode pelapisan tidak langsung dan sistem biotin-streptavidin digunakan untuk mengurangi kerusakan pada struktur antigen. Jika antigen tersebut adalah protein membran, antigen tersebut dapat ditampilkan pada permukaan sel utuh atau digunakan untuk mensimulasikan lingkungan membran, seperti nanodisk, untuk mempertahankan konformasi protein membran alaminya.

Selain eksperimen rutin seperti ELISA, Western Blotting (WB), dan Imunofluoresensi (IF), teknik deteksi Surface Plasmon Resonance (SPR) dan Bio-Layer Interferometry (BLI) dapat digunakan untuk memantau proses pengikatan dan disosiasi antibodi dan antigen secara real-time, sehingga memungkinkan penentuan parameter afinitas dan kinetik.

Teknik phage display dapat digunakan untuk menghasilkan antibodi monoklonal dengan afinitas tinggi untuk berbagai spesies penghasil antibodi, termasuk tetapi tidak terbatas pada manusia, tikus, kelinci, ayam, unta, alpaka, sapi, anjing, domba, monyet, dan hiu.

Teknologi pembuatan pustaka antibodi tikus sudah mapan, hemat biaya, dan memiliki durasi eksperimen yang singkat, sehingga cocok untuk penyaringan antibodi awal dan penelitian dasar. Antibodi kelinci menunjukkan afinitas dan spesifisitas yang kuat, dengan rentang pengenalan epitop yang lebih luas dibandingkan dengan antibodi tikus. Antibodi manusia dapat diperoleh langsung dari pustaka antibodi manusia, sehingga menghindari potensi reaksi imun yang mungkin terjadi ketika antibodi heterolog diberikan ke tubuh manusia. Pendekatan ini memiliki nilai signifikan dalam penelitian dan pengembangan obat, khususnya dalam pembuatan antibodi terapeutik.

Imunogen hewan umumnya dibagi menjadi antigen protein, antigen polipeptida, antigen asam nukleat, dan antigen terkait patogen, di mana antigen terkait patogen meliputi antigen virus (partikel virus lengkap, protein virus, protein non-struktural virus, dll.), antigen bakteri (ekstrak bakteri lengkap, komponen dinding sel, protein yang disekresikan, toksin, dll.) dan antigen parasit.

Sesuaikan imunogen dengan mengganti antigen imun dengan protein rekombinan dan mengganti partikel virus pemadam api dengan protein struktural virus. Sesuaikan desain eksperimen dan modifikasi dosis imun.

Imunogenisitas dapat ditingkatkan dengan menggabungkan antigen dengan protein pembawa, seperti albumin serum sapi. Selain itu, adjuvan imun, termasuk adjuvan Freund dan adjuvan aluminium, dapat digunakan untuk memperpanjang waktu tinggal in vivo dan merangsang aktivasi serta proliferasi sel imun, sehingga meningkatkan imunogenisitas.

Pustaka antibodi fage adalah kumpulan beragam antibodi fage yang dibuat dengan merakit serangkaian lengkap gen daerah variabel dari antibodi ke dalam vektor fage dan mengekspresikannya pada permukaan fage. Proses ini menghasilkan pembentukan pustaka antibodi fage.

Proses umum dari phage display melibatkan beberapa langkah kunci: mengekstrak sel mononuklear darah tepi (PBMC) dari hewan yang diimunisasi, mengisolasi total RNA dan mentranskripsikannya menjadi DNA komplementer (cDNA), memperbanyak gen target menggunakan teknologi reaksi berantai polimerase (PCR), mengkloning gen target ke dalam vektor fage, dan mentransformasikan vektor ke dalam sel inang untuk ekspresi. Proses ini menghasilkan konstruksi pustaka phage display, yang dapat dengan cepat mengidentifikasi antibodi dengan afinitas tinggi. Selanjutnya, pustaka ini dapat berfungsi sebagai sumber daya yang berharga untuk pengembangan vaksin, obat terapeutik, dan reagen diagnostik.

Berdasarkan sumber pustaka antibodi, pustaka antibodi fage dapat dikategorikan menjadi pustaka antibodi fage imun dan pustaka antibodi fage asli. Perbedaan utama antara kedua jenis ini terletak pada apakah hewan tersebut telah divaksinasi. Selain itu, pustaka antibodi asli dapat dihasilkan melalui semi-sintesis atau sintesis.

Terdapat dua indeks utama untuk mengevaluasi kualitas pustaka antibodi: kapasitas penyimpanan dan keragaman. Kapasitas penyimpanan yang besar, dikombinasikan dengan keragaman yang tinggi, memastikan penyaringan antibodi yang efektif dengan afinitas dan spesifisitas yang tinggi.

Dalam proses elutriasi biologis, pustaka tampilan diinkubasi dengan target tetap dan kemudian dicuci secara ekstensif untuk menghilangkan fage yang tidak reaktif. Konjugat biasanya dieluasi menggunakan larutan asam atau garam tinggi dan selanjutnya diperbanyak dalam sel inang yang sesuai untuk pengayaan. Setelah 3 hingga 5 putaran penyaringan, antibodi dengan afinitas tinggi diperoleh.

Metode penyaringan fage terutama meliputi penyaringan fase padat, penyaringan fase cair, dan penyaringan berbasis sel. Pemilihan metode penyaringan yang tepat harus mempertimbangkan karakteristik molekul target, tujuan proses penyaringan, dan lingkungan laboratorium.

Penyaringan positif adalah metode paling mendasar untuk menyaring antibodi fage yang berikatan dengan protein target. Penyaringan negatif berfungsi untuk menghilangkan antibodi nonspesifik. Selama proses penyaringan antibodi fage, antibodi nonspesifik dapat diidentifikasi karena interferensi dari label antigen target, bahan, atau antigen lain dengan kemiripan struktural dengan antigen target. Dalam kasus seperti itu, penyaringan negatif dapat meningkatkan efisiensi proses penyaringan.

Metode untuk verifikasi antibodi biasanya meliputi ELISA, Western Blotting (WB), flow cytometry, imunopresipitasi (IP), imunofluoresensi (IF), imunohistokimia, dan berbagai teknik eksperimental lainnya. Alpha Lifetech memiliki pengalaman luas dalam deteksi antibodi dan memiliki tim eksperimental profesional, yang memastikan efektivitas antibodi dalam eksperimen selanjutnya.