Platform Pengembangan Humanisasi Antibodi

Antibodi humanisasi memicu respons minimal atau tidak sama sekali dari sistem imun manusia. Menurut Cognitive Market Research, ukuran pasar Humanisasi Antibodi global adalah USD 92,5 juta pada tahun 2024 dan akan berkembang pada tingkat pertumbuhan tahunan gabungan (CAGR) sebesar 13,00% dari tahun 2024 hingga 2031. Alpha Lifetech memiliki platform humanisasi antibodi yang matang, dengan tingkat keberhasilan lebih dari 98% untuk antibodi humanisasi. Kami memiliki beberapa strategi humanisasi, termasuk pencangkokan CDR, pencangkokan SDR, pengocokan rantai, tampilan fag, dll., yang dapat dipilih sesuai dengan kebutuhan eksperimen Anda. Kami tidak hanya dapat menyediakan humanisasi antibodi dari berbagai spesies, seperti tikus, kelinci, alpaka, unta, dll., tetapi juga humanisasi antibodi dalam berbagai bentuk, seperti scFv, Fab, dan nanobodi. Kami memiliki tenaga teknis profesional untuk menyediakan layanan produksi, pemurnian, dan validasi antibodi, termasuk produksi antibodi monoklonal tikus, produksi antibodi chimeric, ekspresi dan pemurnian antibodi humanisasi, serta karakterisasi dan analisis antibodi humanisasi. Dengan tingkat keberhasilan yang tinggi, kemurnian tinggi, dan imunogenisitas rendah, kami menjamin produksi antibodi humanisasi.

Pengantar Humanisasi Antibodi

Terapi antibodi monoklonal dapat digunakan untuk pengobatan penyakit autoimun, kanker, dan penyakit lainnya. Antibodi monoklonal diproduksi dengan mengimunisasi tikus atau hewan lainnya. Bila digunakan untuk mengobati penyakit pada tahap akhir produksi antibodi monoklonal, imunogenisitas antibodi nonmanusia tidak dapat diabaikan. Prinsip utama humanisasi adalah mengintegrasikan residu kerangka kerja nonmanusia, seperti daerah penentu komplementaritas hipervariabel (CDR), ke dalam kerangka kerja manusia, menghasilkan sekuens yang mempertahankan karakteristik antibodi asli sekaligus mencegah imunogenisitas. Imunisasi tikus dan humanisasi sekuens tikus berikutnya tetap menjadi dua jalur utama untuk menemukan antibodi terapeutik, yang terutama melalui beberapa tahap: produksi antibodi tikus, kimerisasi antibodi monoklonal, antibodi monoklonal manusia tikus kimerik, dan proses pengembangan antibodi monoklonal yang sepenuhnya terhumanisasi. Saat ini, penelitian terutama meliputi tikus transgenik (mentransfer gen sel B manusia ke tikus), penyaringan berthroughput tinggi menggunakan teknologi tampilan ragi atau fag, pencangkokan CDR (memasukkan CDR induk ke dalam sekuens manusia), residu penentuan spesifik transplantasi (SDR), pengocokan kerangka kerja, dan metode lainnya.

Gambar 1: Gambaran skematis humanisasi antibodi dari antibodi murine (domain hijau) menjadi antibodi manusia sepenuhnya.

Strategi humanisasi antibodi

Pencangkokan CDR

Pencangkokan CDR dicapai melalui sistem ekspresi mamalia berdasarkan teknologi DNA rekombinan, dan langkah-langkah utamanya adalah:

(1) Mengembangkan antibodi yang sesuai pada tikus (atau sumber non-manusia), mengisolasi DNA yang mengkode antibodi, dan mengkloningnya ke dalam vektor untuk pengurutan (atau langsung melakukan pengurutan sel tunggal).

(2) Untuk menentukan urutan DNA yang sesuai dengan CDR antibodi dan untuk menentukan spesifisitas pengikatan target;

(3) Pilih wilayah kerangka manusia (FR) untuk mentransplantasikan CDR non-manusia dan membangun gen antibodi baru.

(4) Melakukan analisis tiga dimensi konflik antara CDR non-manusia dan FR manusia untuk menghasilkan mutasi pemulihan untuk menstabilkan loop dan mencegah hilangnya afinitas atau integritas struktural antibodi humanisasi akhir.

Gambar 2: Gambaran skematik pencangkokan daerah penentu komplementaritas (CDR).

Perombakan kerangka kerja

Pengacakan kerangka kerja bergantung pada teknologi tampilan fag dan teknologi penyaringan pustaka fag untuk memperoleh antibodi afinitas tinggi. Oligonukleotida yang mengkodekan kerangka kerja rantai berat antibodi manusia digunakan sebagai templat, daerah CDR dikodekan sebagai primer, dan amplifikasi PCR dilakukan untuk mendenaturasi produk PCR guna memperoleh DNA untai tunggal. DNA untai tunggal gen VL dan VH yang dimurnikan dengan streptavidin direkonstruksi ke dalam vektor menggunakan ligase DNA T4 dan enzim restriksi, diinkubasi dengan bakteriofag, dan diperkuat oleh bakteriofag, dan pustaka tampilan fag dibangun. Tiga putaran penyaringan dengan antigen yang sesuai dilakukan, dan klon positif akhirnya diverifikasi menggunakan ELISA dan metode lainnya.

Gambar 3: Ilustrasi skematik dari strategi humanisasi pencangkokan wilayah penentu komplementaritas (CDR) dan perombakan kerangka kerja (FR). (A) Prosedur utama pencangkokan CDR. (B) Proses utama perombakan FR. (Sumber referensi:Wang Yongmei, dkk., Perbandingan “pengocokan kerangka kerja” dan “pencangkokan CDR” dalam humanisasi antibodi murine PD-1.)

Tampilan Fag

Produksi antibodi humanisasi didasarkan pada metode menampilkan antibodi spesifik pada permukaan bakteriofag, yang sebagian besar dibuat melalui pustaka fag antibodi manusia. Sumber pustaka tersebut adalah PBMC yang diisolasi dari darah tepi manusia untuk membuat pustaka fag, yang darinya sekuens yang sesuai disaring. Sekuens ini memiliki sekuens manusia yang lengkap, tetapi antibodi yang dihasilkan adalah fragmen antibodi, seperti scFv, Fab, dan nanobody.

Alur Kerja Layanan Humanisasi Antibodi

Langkah-langkah Layanan	Standar QC	Garis Waktu
Isolasi Antibodi	Kemurnian >95%	1-2 minggu
Analisis Urutan	Identifikasi akurat dari urutan non-manusia	1 minggu
Pencangkokan CDR dan Pencangkokan Kerangka	Integrasi dan ekspresi yang sukses	2-3 minggu
Ekspresi dan Pemurnian	Hasil tinggi dan kemurnian	2-3 minggu
Validasi Fungsional	Penilaian afinitas dan spesifisitas	1 minggu