Layanan Penelitian Aptamer

Pengantar Aptamer

Aptamer adalah molekul asam nukleat untai tunggal (seperti DNA atau RNA) yang disaring secara in vitro dari pustaka oligonukleotida sintetis dengan urutan yang ditetapkan secara acak melalui proses yang disebut penyaringan SELEX, yang melibatkan beberapa putaran pemilihan berulang. Komponen utama layanan pengembangan aptamer yang dimiliki oleh Alpha Lifetech meliputi konstruksi pustaka aptamer, penyaringan SELEX aptamer, pengurutan SELEX aptamer, analisis urutan aptamer, dan analisis aptamer lainnya.

Pengurutan SELEX menggabungkan penyaringan SELEX aptamer dan pengurutan berthroughput tinggi. Melalui pengurutan SELEX aptamer, urutan spesifik aptamer yang terikat pada target dapat ditentukan secara efisien, sehingga menyediakan data dasar untuk analisis dan penerapan urutan aptamer berikutnya.

Aptamer telah banyak digunakan dalam penelitian ilmiah, pengobatan penyakit, konstruksi biosensor, penemuan obat-obatan, dan pemantauan lingkungan. Akan tetapi, aptamer oligonukleotida yang disaring secara in vitro mudah terdegradasi secara in vivo dan bahkan menunjukkan toksisitas. Oleh karena itu, setelah mengoptimalkan aptamer yang disaring, analisis in vitro diperlukan untuk mengevaluasi keberhasilan pengembangan aptamer. Berdasarkan berbagai kebutuhan analisis pelanggan, Alpha Lifetech memiliki berbagai strategi analisis aptamer yang dapat dipilih pelanggan.

Gambar 1 Diagram analisis aptamer. Sumber referensi:Thevendran R, Citartan M. 2022. Uji untuk Memperkirakan Afinitas Pengikatan Aptamer.

Pengantar Layanan Penelitian Aptamer

Analisis Stabilitas Aptamer

Percobaan degradasi nuklease

Dengan menginkubasi aptamer dengan berbagai jenis nuklease (seperti DNase, RNase, dll.) dalam kondisi tertentu, degradasi aptamer diamati, sehingga dapat mengevaluasi kemampuan antidegradasinya. Hal ini bermanfaat untuk menentukan stabilitas dan ketahanan aptamer dalam aplikasi praktis.

Metode pelabelan fluoresensi

Stabilitas aptamer dievaluasi secara tidak langsung dengan memberi label fluorofor pada aptamer dan mengamati perubahan sinyal fluoresensi sebelum dan setelah berikatan dengan target. Misalnya, ketika aptamer berikatan dengan target, konformasinya dapat berubah, sehingga menghasilkan sinyal fluoresensi yang meningkat atau menurun.

Analisis stabilitas termal

Stabilitas termal aptamer dinilai dengan mengukur perubahan suhu lelehnya (nilai Tm) pada suhu yang berbeda. Semakin tinggi suhu leleh aptamer, semakin baik stabilitas termalnya.

Analisis stabilitas dinamis

Resonansi plasmon permukaan (SPR) dan teknologi lainnya digunakan untuk memantau proses pengikatan dan pelepasan antara aptamer dan target secara real time, memperoleh parameter dinamis (seperti konstanta laju pengikatan, konstanta laju disosiasi, dll.), lebih jauh memahami mekanisme interaksi antara aptamer dan target, dan mengevaluasi stabilitas dinamisnya.

Analisis stabilitas struktural

Kristalografi sinar-X, resonansi magnetik nuklir (NMR), dan teknik biologi struktural lainnya digunakan untuk menganalisis struktur tiga dimensi aptamer dan stabilitas strukturalnya.

Analisis Spesifik Aptamer

Uji pengikatan aptamer

Afinitas dinilai dengan melakukan uji pengikatan aptamer untuk mengukur konstanta pengikatan antara aptamer dan molekul target, seperti konstanta disosiasi Kd. Nilai Kd yang lebih rendah menunjukkan afinitas yang lebih tinggi. Uji pengikatan aptamer dapat menyaring kandidat obat dengan kemampuan pengikatan yang tinggi, dan kemudian melakukan studi farmakodinamik dan farmakokinetik berikutnya.

Percobaan penyaringan terbalik

Uji penyaringan terbalik adalah metode penyaringan untuk segera menyingkirkan molekul nontarget dari sejumlah besar molekul kandidat. Penyaringan terbalik dirancang untuk menyingkirkan molekul yang tidak memiliki sifat atau fungsi ini. Kunci untuk penyaringan terbalik adalah memilih penanda atau kondisi penyaringan terbalik yang tepat yang memungkinkan molekul nontarget diidentifikasi dan disingkirkan selama proses penyaringan. Dalam percobaan ini, pemilihan molekul nontarget sangat penting. Harus dipastikan bahwa molekul nontarget yang dipilih mewakili zat yang dapat mengganggu penyaringan aptamer dan bahwa kemungkinan faktor pengganggu tercakup selengkap mungkin.

Percobaan penghambatan kompetitif

Dengan menambahkan kompetitor yang berlebihan (seperti molekul dengan struktur yang mirip dengan molekul target) ke sistem pengikatan aptamer dan molekul target, perubahan kemampuan pengikatan aptamer dan molekul target diamati. Jika kemampuan aptamer untuk mengikat molekul target berkurang secara signifikan, ini menunjukkan bahwa aptamer memiliki spesifisitas yang tinggi.

Dalam beberapa kasus, eksperimen penghambatan kompetitif dapat digunakan sebagai bagian dari atau sebagai pelengkap eksperimen penyaringan terbalik. Misalnya, dalam proses penyaringan obat, kemampuan molekul obat untuk mengikat protein target dapat dievaluasi melalui eksperimen penghambatan kompetitif, dan kemudian eksperimen penyaringan terbalik dapat digunakan untuk menghilangkan senyawa yang terlalu kuat terikat pada sel atau jaringan normal.

Analisis Sitotoksisitas Aptamer

Ada berbagai metode eksperimental untuk analisis sitotoksisitas aptamer, yang dirancang untuk mengevaluasi efek aptamer pada kelangsungan hidup, proliferasi, atau fungsi sel.

Metode	Pengantar Rinci	Keuntungan	Kerugian
Metode Deteksi MTT	Pengujian MTT merupakan metode yang didasarkan pada aktivitas enzim dalam mitokondria sel hidup. Suksinat dehidrogenase dalam mitokondria sel hidup dapat mereduksi MTT eksogen menjadi kristal Formazan berwarna biru-ungu yang tidak larut dalam air dan menyimpannya dalam sel, sedangkan sel yang mati tidak memiliki fungsi tersebut. Melarutkan kristal ini dengan dimetil sulfoksida (DMSO) dan mendeteksi absorbansi pada panjang gelombang tertentu (seperti 490nm atau 570nm) pada enzimometer dapat secara tidak langsung mencerminkan jumlah sel hidup dan dengan demikian menilai sitotoksisitas aptamer.	Sensitivitas tinggi, ekonomis dan nyaman	Beban kerja yang berat, pelarut organik dapat menyebabkan kerusakan sel; Hanya hasil eksperimen akhir yang dapat diperoleh, dan proses sitotoksisitas lengkap tidak dapat dilihat
Metode Deteksi CCK-8	Cell Counting Kit-8 (CCK-8) adalah metode deteksi kolorimetrik non-radioaktif dengan sensitivitas tinggi. CCK-8 mengandung WST-8, yang direduksi oleh dehidrogenase dalam mitokondria sel hidup untuk menghasilkan bahan bakar metil zan oranye yang sangat larut dalam air. Jumlah pewarna mezan yang diproduksi berhubungan secara linear dengan jumlah sel hidup, dan jumlah sel hidup dapat dicerminkan secara tidak langsung dengan mengukur nilai serapan cahaya pewarna Mezan pada panjang gelombang 450nm, sehingga dapat mengevaluasi sitotoksisitas aptamer.	Pengoperasian sederhana, tidak perlu mencuci sel, deteksi cepat, jangkauan deteksi linier lebar, sensitivitas tinggi, pengulangan yang baik, sedikit sitotoksisitas	Harga reagen tinggi; Terkadang sulit untuk mengetahui apakah penurunan absorbansi disebabkan oleh penurunan jumlah sel hidup atau penurunan aktivitas dehidrogenase sel itu sendiri.
Metode Deteksi LDH	LDH (laktat dehidrogenase) adalah enzim yang stabil dalam sitoplasma sel, dan ketika membran sel rusak, LDH dilepaskan ke luar sel. LDH dapat mengkatalisis asam laktat untuk membentuk piruvat, dan bereaksi dengan INT (garam tetrazolium) untuk membentuk zat kristal berwarna ungu. Dengan mengukur absorbansinya pada panjang gelombang tertentu (seperti 490nm), tingkat kerusakan sel dapat tercermin, dan kemudian sitotoksisitas aptamer dapat dievaluasi.	Ini secara langsung mencerminkan tingkat kematian sel, dan memiliki lebih sedikit kerusakan pada sel, dan tidak ada kontaminasi isotop radioaktif	Kebutuhan untuk sering mengeluarkan sel dari inkubator, operasinya lebih rumit; Hanya hasil eksperimen akhir yang dapat diperoleh, dan proses sitotoksisitas lengkap tidak dapat dilihat
Analisis Pencitraan Sel Hidup Secara Real-Time	Dengan menggunakan penganalisis pencitraan sel hidup secara real-time, instrumen tersebut ditempatkan dalam inkubator untuk mengamati dan merekam seluruh proses siklus pertumbuhan sel secara real-time. Sitotoksisitas aptamer dapat dievaluasi dengan menganalisis perubahan morfologi dan kurva pertumbuhan sel. Metode ini dapat memberikan hasil video dan kuantitatif dari proses sitotoksik sekaligus menjaga lingkungan pertumbuhan sel tetap stabil.	Dapat memantau proses sitotoksik secara real time, pencitraan non-destruktif, mengurangi gangguan dan kerusakan pada sel; Hasil video dan hasil kuantitatif tersedia untuk analisis mendalam.	Biaya peralatannya tinggi dan membutuhkan keterampilan operasi profesional dan kemampuan analisis data

KACHI

Keunggulan Layanan Penelitian Aptamer

Kontrol Kualitas Total

Aptamer yang dioptimalkan dengan stabilitas lebih tinggi

Ekonomis dan efisien. Harga lebih kompetitif, layanan lebih baik

Situs penelitian yang komprehensif dan berbagai metode penelitian

Konsultasi pra-penjualan profesional dan layanan dukungan purna jual

Pengalaman yang kaya dalam analisis aptamer

Tim R&D tingkat tinggi

Layanan terkait aptamer yang disesuaikan

Kembali ke Halaman Platform Pengembangan Aptamer

Jika Anda memiliki pertanyaan, jangan ragu untuk menghubungi kami kapan saja.

Leave Your Message

Layanan Unggulan

01tanggal 02