Layanan Penelitian Aptamer

Pengantar Aptamer

Aptamer adalah molekul asam nukleat beruntai tunggal (seperti DNA atau RNA) yang disaring secara in vitro dari pustaka oligonukleotida sintetik dengan urutan yang ditetapkan secara acak melalui proses yang disebut penyaringan SELEX, yang melibatkan beberapa putaran seleksi iteratif. Komponen utama layanan pengembangan aptamer yang dimiliki oleh Alpha Lifetech meliputi pembuatan pustaka aptamer, penyaringan SELEX aptamer, pengurutan SELEX aptamer, analisis urutan aptamer, dan analisis aptamer lainnya.

Sekuensing SELEX menggabungkan penyaringan SELEX aptamer dan sekuensing berkecepatan tinggi. Melalui sekuensing SELEX aptamer, urutan spesifik aptamer yang terikat pada target dapat ditentukan secara efisien, memberikan data dasar untuk analisis dan aplikasi urutan aptamer selanjutnya.

Aptamer telah banyak digunakan dalam penelitian ilmiah, pengobatan penyakit, pembuatan biosensor, penemuan obat, dan pemantauan lingkungan. Namun, aptamer oligonukleotida yang disaring secara in vitro mudah terdegradasi secara in vivo dan bahkan menunjukkan toksisitas. Oleh karena itu, setelah mengoptimalkan aptamer yang telah disaring, analisis in vitro diperlukan untuk mengevaluasi keberhasilan pengembangan aptamer. Sesuai dengan kebutuhan analisis yang berbeda dari pelanggan, Alpha Lifetech memiliki berbagai strategi analisis aptamer yang dapat dipilih pelanggan.

Gambar 1. Diagram analisis aptamer. Sumber referensi:Thevendran R, Citartan M. 2022. Pengujian untuk Memperkirakan Afinitas Pengikatan Aptamer.

Pengantar Layanan Penelitian Aptamer

Analisis Stabilitas Aptamer

Percobaan degradasi nuklease

Dengan menginkubasi aptamer dengan berbagai jenis nuklease (seperti DNase, RNase, dll.) dalam kondisi tertentu, degradasi aptamer diamati, sehingga dapat dievaluasi kemampuan anti-degradasinya. Hal ini bermanfaat untuk menentukan stabilitas dan daya tahan aptamer dalam aplikasi praktis.

Metode pelabelan fluoresen

Stabilitas aptamer dievaluasi secara tidak langsung dengan memberi label pada fluorofor pada aptamer dan mengamati perubahan sinyal fluoresensi sebelum dan sesudah berikatan dengan target. Misalnya, ketika aptamer berikatan dengan target, konformasinya dapat berubah, sehingga menghasilkan sinyal fluoresensi yang meningkat atau menurun.

Analisis stabilitas termal

Stabilitas termal aptamer dinilai dengan mengukur perubahan suhu lelehnya (nilai Tm) pada suhu yang berbeda. Semakin tinggi suhu leleh aptamer, semakin baik stabilitas termalnya.

Analisis stabilitas dinamis

Resonansi plasmon permukaan (SPR) dan teknologi lainnya digunakan untuk memantau proses pengikatan dan pelepasan antara aptamer dan target secara real-time, memperoleh parameter dinamis (seperti konstanta laju pengikatan, konstanta laju disosiasi, dll.), lebih memahami mekanisme interaksi antara aptamer dan target, serta mengevaluasi stabilitas dinamisnya.

Analisis stabilitas struktural

Kristalografi sinar-X, resonansi magnetik nuklir (NMR), dan teknik biologi struktural lainnya digunakan untuk menganalisis struktur tiga dimensi aptamer dan stabilitas strukturnya.

Analisis Spesifik Aptamer

Pengujian pengikatan aptamer

Afinitas dinilai dengan melakukan uji pengikatan aptamer untuk mengukur konstanta pengikatan antara aptamer dan molekul target, seperti konstanta disosiasi Kd. Nilai Kd yang lebih rendah menunjukkan afinitas yang lebih tinggi. Uji pengikatan aptamer dapat menyaring kandidat obat dengan kemampuan pengikatan yang tinggi, dan kemudian melakukan studi farmakodinamik dan farmakokinetik selanjutnya.

Percobaan penyaringan terbalik

Pengujian skrining terbalik adalah metode skrining untuk dengan cepat mengecualikan molekul non-target dari sejumlah besar molekul kandidat. Skrining terbalik dirancang untuk mengecualikan molekul yang tidak memiliki sifat atau fungsi ini. Kunci dari skrining terbalik adalah memilih penanda atau kondisi skrining terbalik yang tepat yang memungkinkan molekul non-target diidentifikasi dan dihilangkan selama proses skrining. Dalam percobaan ini, pemilihan molekul non-target sangat penting. Harus dipastikan bahwa molekul non-target yang dipilih mewakili zat yang dapat mengganggu skrining aptamer dan bahwa faktor-faktor pengganggu yang mungkin terjadi tercakup selengkap mungkin.

Percobaan penghambatan kompetitif

Dengan menambahkan kompetitor berlebih (seperti molekul dengan struktur yang mirip dengan molekul target) ke sistem pengikatan aptamer dan molekul target, perubahan kemampuan pengikatan aptamer dan molekul target diamati. Jika kemampuan aptamer untuk mengikat molekul target berkurang secara signifikan, hal itu menunjukkan bahwa aptamer memiliki spesifisitas yang tinggi.

Dalam beberapa kasus, eksperimen inhibisi kompetitif dapat digunakan sebagai bagian dari atau sebagai tambahan untuk eksperimen penyaringan balik. Misalnya, dalam proses penyaringan obat, kemampuan molekul obat untuk berikatan dengan protein target dapat dievaluasi melalui eksperimen inhibisi kompetitif, dan kemudian eksperimen penyaringan balik dapat digunakan untuk menghilangkan senyawa yang terlalu kuat berikatan dengan sel atau jaringan normal.

Analisis Sitotoksisitas Aptamer

Terdapat beragam metode eksperimental untuk analisis sitotoksisitas aptamer, yang dirancang untuk mengevaluasi efek aptamer pada kelangsungan hidup, proliferasi, atau fungsi sel.

Metode	Pengantar Terperinci	Keuntungan	Kerugian
Metode Deteksi MTT	Uji MTT adalah metode yang didasarkan pada aktivitas enzim di mitokondria sel hidup. Suksinat dehidrogenase di mitokondria sel hidup dapat mereduksi MTT eksogen menjadi kristal Formazan berwarna biru-ungu yang tidak larut dalam air dan menyimpannya di dalam sel, sedangkan sel mati tidak memiliki fungsi tersebut. Melarutkan kristal ini dengan dimetil sulfoksida (DMSO) dan mendeteksi absorbansi pada panjang gelombang tertentu (seperti 490nm atau 570nm) pada enzimometer dapat secara tidak langsung mencerminkan jumlah sel hidup dan dengan demikian menilai sitotoksisitas aptamer.	Sensitivitas tinggi, ekonomis, dan nyaman.	Beban kerja yang berat, pelarut organik dapat menyebabkan kerusakan pada sel; Hanya hasil eksperimen akhir yang dapat diperoleh, dan proses sitotoksisitas secara lengkap tidak dapat dilihat.
Metode Deteksi CCK-8	Cell Counting Kit-8 (CCK-8) adalah metode deteksi kolorimetri non-radioaktif dengan sensitivitas tinggi. CCK-8 mengandung WST-8, yang direduksi oleh dehidrogenase di mitokondria sel hidup untuk menghasilkan zat warna metil zan oranye yang sangat larut dalam air. Jumlah zat warna mezan yang dihasilkan berbanding lurus dengan jumlah sel hidup, dan jumlah sel hidup dapat secara tidak langsung tercermin dengan mengukur nilai penyerapan cahaya zat warna mezan pada panjang gelombang 450nm, sehingga dapat mengevaluasi sitotoksisitas aptamer.	Pengoperasian sederhana, tidak perlu mencuci sel, deteksi cepat, rentang deteksi linier luas, sensitivitas tinggi, pengulangan yang baik, toksisitas rendah.	Harga reagen yang tinggi; Terkadang sulit untuk menentukan apakah penurunan absorbansi disebabkan oleh penurunan jumlah sel hidup atau penurunan aktivitas dehidrogenase sel itu sendiri.
Metode Deteksi LDH	LDH (laktat dehidrogenase) adalah enzim yang stabil di sitoplasma sel, dan ketika membran sel rusak, LDH dilepaskan ke luar sel. LDH dapat mengkatalisis asam laktat untuk membentuk piruvat, dan bereaksi dengan INT (garam tetrazolium) untuk membentuk zat kristal ungu. Dengan mengukur absorbansinya pada panjang gelombang tertentu (seperti 490 nm), tingkat kerusakan sel dapat tercermin, dan kemudian sitotoksisitas aptamer dapat dievaluasi.	Hal ini secara langsung mencerminkan tingkat kematian sel, dan memiliki kerusakan sel yang lebih sedikit, serta tidak ada kontaminasi isotop radioaktif.	Kebutuhan untuk sering mengeluarkan sel dari inkubator membuat pengoperasiannya lebih rumit; hanya hasil eksperimen akhir yang dapat diperoleh, dan proses sitotoksisitas secara lengkap tidak dapat diamati.
Analisis Pencitraan Sel Hidup Waktu Nyata	Dengan menggunakan alat analisis pencitraan sel hidup waktu nyata, instrumen ditempatkan di dalam inkubator untuk mengamati dan merekam seluruh proses siklus pertumbuhan sel secara waktu nyata. Sitotoksisitas aptamer dapat dievaluasi dengan menganalisis perubahan morfologi dan kurva pertumbuhan sel. Metode ini dapat memberikan hasil video dan kuantitatif dari proses sitotoksik sambil menjaga lingkungan pertumbuhan sel tetap stabil.	Alat ini dapat memantau proses sitotoksik secara real-time, pencitraan non-destruktif, mengurangi gangguan dan kerusakan pada sel; baik hasil video maupun hasil kuantitatif tersedia untuk analisis mendalam.	Biaya peralatannya tinggi dan membutuhkan keterampilan pengoperasian profesional serta kemampuan analisis data.

KACHI

Keunggulan Layanan Penelitian Aptamer

Pengendalian Mutu Total

Aptamer yang dioptimalkan dengan stabilitas lebih tinggi

Ekonomis dan efisien. Harga lebih kompetitif, pelayanan lebih baik.

Lokasi penelitian yang komprehensif dan beragam metode penelitian.

Layanan konsultasi pra-penjualan dan dukungan purna-penjualan profesional.

Pengalaman yang kaya dalam analisis aptamer

Tim R&D tingkat tinggi

Layanan terkait aptamer yang disesuaikan

Kembali ke Halaman Platform Pengembangan Aptamer

Jika Anda memiliki pertanyaan, jangan ragu untuk menghubungi kami kapan saja.

Leave Your Message

Layanan Unggulan

0102