Protokol dan Pertanyaan yang Sering Diajukan (FAQ) tentang Flow Cytometry (FCM/FC)

Flow cytometry adalah teknologi baru yang dikembangkan pada akhir tahun 1960-an, yang menggunakan flow cytometer untuk menganalisis karakteristik fisik dan kimia populasi sel secara cepat dan kuantitatif, serta memilah sel secara akurat berdasarkan karakteristik fisik dan kimia tersebut. Teknologi ini terutama terdiri dari dua bagian: analisis aliran dan pemilahan aliran. Flow cytometry mencerminkan karakteristik fisik dan kimia sel dengan menerima sinyal cahaya yang tersebar dan sinyal fluoresensi setelah penyinaran laser pada sel dalam aliran, seperti ukuran sel, ukuran partikel, dan ekspresi molekul antigen.

Prinsip Flow Cytometry

Sinar laser dengan panjang gelombang tertentu secara langsung menerangi sel-sel dalam aliran fluida bertekanan tinggi, dan sinyal optik yang dihasilkan diterima oleh beberapa penerima. Salah satunya adalah sinyal cahaya hamburan (hamburan sudut maju) yang diterima dalam arah linier sinar laser, dan yang lainnya adalah sinyal cahaya yang diterima dalam arah vertikal sinar laser, termasuk sinyal cahaya hamburan (hamburan sudut lateral) dan sinyal fluoresensi. Sel atau partikel dengan diameter 0,2 ~ 150 μm yang tersuspensi dalam aliran cairan dapat menghamburkan sinar laser, dan fluorescein yang terikat pada sel dapat memancarkan fluoresensi setelah dieksitasi oleh laser. Sinyal cahaya hamburan dan sinyal fluoresensi diterima oleh penerima yang sesuai, dan karakteristik fisik dan kimia setiap sel dapat tercermin sesuai dengan fluktuasi sinyal yang diterima.

Flow cytometry memiliki tiga elemen utama, yaitu flow cytometry, sel sampel, dan pewarna fluoresen atau antibodi yang dikonjugasikan dengan fluorescein.

Objek dari sitometri aliran adalah suspensi sel tunggal. Sitometri aliran tidak dapat mendeteksi sel secara langsung dalam blok jaringan. Untuk mendeteksi sel dalam organ atau jaringan, organ atau jaringan harus disiapkan menjadi suspensi sel tunggal dengan berbagai metode, dan kemudian diberi label dengan antibodi terkonjugasi fluorescein sebelum dapat dideteksi oleh sitometri aliran. Sitometri aliran tidak dapat mendeteksi molekul secara langsung, tetapi dapat mendeteksi molekul secara tidak langsung dengan menggunakan partikel sintetis sebagai pengganti sel dan kemudian menggabungkan antibodi molekul tersebut dengan partikel buatan, seperti metode CBA untuk mendeteksi sitokin.

Langkah-langkah Sitometri Aliran

Persiapan Sampel

Persiapan sampel merupakan salah satu langkah paling penting dalam eksperimen sitometri aliran. Memastikan kualitas suspensi sel secara langsung memengaruhi keakuratan hasil eksperimen. Langkah-langkah spesifiknya adalah sebagai berikut:

Pemisahan sel

Sel diekstraksi dari jaringan atau darah, yang dapat diisolasi terlebih dahulu melalui sentrifugasi, penyaringan sel, dan metode lainnya.

Penghitungan Sel

Konsentrasi sel yang sesuai (umumnya 1 × 10 hingga 1 × 10 sel/ml) dipastikan dengan penghitungan mikroskopis atau instrumen penghitung sel otomatis. Pembersihan sel: Terkadang sel perlu dibersihkan untuk menghilangkan kemungkinan kotoran dan protein dalam larutan, sehingga mengurangi gangguan pada hasil analisis. Sel dicuci dengan larutan penyangga PBS.

Fiksasi sel (opsional)

Jika komponen internal sel perlu dianalisis, sel mungkin perlu difiksasi. Bahan fiksatif yang umum digunakan antara lain formaldehida, etanol, dan lain sebagainya.

Memberi label pada sel

Memberi label pada sel dengan antibodi fluoresen atau pewarna fluoresen lainnya untuk mendeteksi molekul spesifik pada permukaan sel atau di dalam sel selama analisis selanjutnya.

Injeksi Sampel

Suspensi sel yang telah diolah dimasukkan ke dalam tabung sampel flow cytometer. Suspensi sel dimasukkan ke dalam flow cytometer melalui tabung yang sangat halus (biasanya tabung berukuran mikron). Sel-sel diarahkan ke keadaan aliran laminar sel tunggal selama proses flow.

Penyinaran Laser

Ketika sel-sel mengalir melalui flow cytometer, sinar laser akan menyinari setiap sel. Panjang gelombang laser dipilih sesuai dengan kebutuhan eksperimen dan karakteristik penanda fluoresen. Panjang gelombang laser yang umum digunakan adalah 488 nm, 633 nm, dan lain sebagainya.

Eksitasi pelabelan fluoresensi

Penanda fluoresen pada permukaan atau di dalam sel akan tereksitasi oleh laser dan memancarkan fluoresensi yang sesuai. Setiap penanda fluoresen memancarkan sinyal fluoresensi yang berbeda pada panjang gelombang tertentu.

Penyebaran cahaya

Selain fluoresensi, hamburan laser oleh sel juga merupakan sinyal penting untuk analisis sitometri aliran. Hamburan cahaya dapat memberikan informasi tentang sifat fisik sel, terutama ukuran dan ukuran partikel sel.

Deteksi Sinyal Optik

Setelah penyinaran laser, sel menghasilkan berbagai sinyal optik, termasuk cahaya hamburan dan sinyal cahaya fluoresen. Flow cytometer dilengkapi dengan beberapa detektor dan filter optik untuk menganalisis sinyal-sinyal ini.

Cahaya hamburan ke depan (FSC)

Intensitas hamburan cahaya ke depan berhubungan dengan ukuran (volume) sel. Semakin besar sel, semakin kuat intensitas hamburan cahaya ke depan. Hamburan cahaya ke depan biasanya digunakan untuk mengukur ukuran sel.

Cahaya hamburan lateral (SSC)

Intensitas hamburan cahaya lateral berkaitan dengan ukuran partikel sel (seperti kompleksitas struktural di dalam sel). Sel dengan ukuran partikel yang lebih besar (seperti sel darah putih) menghasilkan hamburan cahaya lateral yang lebih kuat. Hamburan cahaya lateral digunakan untuk menganalisis struktur internal sel.

Sinyal fluoresensi

Flow cytometer dilengkapi dengan beberapa detektor fluoresensi, yang masing-masing bertanggung jawab untuk menangkap sinyal fluoresensi dalam rentang panjang gelombang yang berbeda. Setiap penanda fluoresensi memiliki panjang gelombang emisi spesifik, dan sinyal-sinyal ini ditangkap dan dianalisis oleh filter dan detektor yang sesuai.

Pemrosesan Sinyal dan Analisis Data

Sinyal cahaya hamburan dan fluoresensi yang terdeteksi diubah menjadi sinyal digital oleh sitometri aliran, dan diproses serta dianalisis oleh komputer. Pemrosesan data biasanya dibagi menjadi langkah-langkah berikut:

Konversi sinyal

Semua sinyal optik (cahaya hamburan dan cahaya fluoresen) diubah menjadi sinyal listrik, diperkuat oleh penguat elektronik, dan kemudian diubah menjadi sinyal digital untuk diproses.

Pengumpulan data

Perangkat lunak komputer menerima data dari setiap sel dan menyimpannya. Cahaya hamburan ke depan, cahaya hamburan lateral, dan sinyal fluoresensi dari setiap sel direkam untuk membentuk kumpulan data multidimensi yang lengkap.

Analisis data

Sesuai dengan tujuan percobaan, perangkat lunak dapat digunakan untuk berbagai analisis. Misalnya, molekul spesifik dalam sel dapat dikuantifikasi berdasarkan intensitas fluoresensi, atau berbagai jenis populasi sel dapat dibedakan berdasarkan intensitas cahaya yang tersebar.

Interpretasi dan Visualisasi Hasil

Data yang dihasilkan oleh flow cytometry biasanya ditampilkan melalui grafik (seperti histogram, scatter plot, peta kepadatan, dll.). Hasil analisis umum meliputi:

Distribusi populasi sel

Distribusi berbagai populasi sel pada hamburan cahaya ke depan dan hamburan cahaya ke samping dianalisis menggunakan diagram sebaran. Berbagai jenis sel (seperti limfosit, monosit, dll.) menunjukkan pola hamburan yang berbeda.

Deteksi pewarna fluoresen

Ekspresi molekul spesifik pada permukaan sel atau di dalam sel dianalisis melalui distribusi sinyal fluoresensi. Misalnya, penggunaan antibodi berlabel anti-CD dapat memetakan peta intensitas fluoresensi dari populasi sel imun tertentu.

Analisis siklus sel

Status siklus sel (seperti fase G0/G1, fase S, fase G2/M, dll.) dianalisis melalui sinyal fluoresensi pewarna DNA (seperti PI, DAPI).

Gambar 1. Perbandingan skematis deteksi konvensional dan spektral dalam sitometri aliran. (Sumber referensi: Sitometri Aliran Spektral.)

Penerapan Flow Cytometry

Flow cytometry banyak digunakan dalam ilmu hayati, kedokteran, penelitian obat, dan bidang lainnya. Aplikasi umum meliputi:

Analisis Imunofenotipik

Dengan memberi label pada antigen yang berbeda, hal ini membantu menentukan karakteristik imun dari populasi sel.

Analisis Siklus Sel

Membantu mempelajari proliferasi sel dan status siklus sel dengan memberi label pada DNA.

Analisis Viabilitas Sel

Proses fisiologis seperti viabilitas sel, apoptosis, dan autofagi dievaluasi.

Pemilahan Sel

Pengelompokan yang akurat berdasarkan karakteristik sel yang berbeda untuk penelitian lebih lanjut.

Alpha Lifetech memiliki pengalaman proyek bertahun-tahun. Dengan latar belakang teknis yang mendalam dan tim profesional, perusahaan ini dapat menyediakan layanan yang disesuaikan untuk pelanggan. Alpha Lifetech menyediakan layanan Flow Cytometry (FCM / FC) untuk memenuhi kebutuhan penelitian ilmiah dan klinis pelanggan.

Pertanyaan yang Sering Diajukan (FAQ)

1. Agregasi sel menyebabkan terbentuknya sinyal yang tumpang tindih dari beberapa sel dalam instrumen, yang memengaruhi akurasi data.

Penyebab: Konsentrasi sel terlalu tinggi atau terlalu rendah. Sel rusak atau menempel selama perawatan. Sampel mungkin mengandung pengotor atau gumpalan sel yang tidak terdispersi. Solusi: (1) Pengenceran sel yang tepat: Pastikan konsentrasi sel berada dalam kisaran yang direkomendasikan oleh instrumen, biasanya dari 1 × 10 Ω hingga 1 × 10 Ω sel/mL. (2) Penggunaan agen deagregasi: Sejumlah agen deagregasi yang sesuai, seperti DNase, EDTA, dll., dapat ditambahkan untuk membantu mendispersikan sel. (3) Optimalkan penanganan sampel: Gunakan operasi steril untuk menghindari osilasi berlebihan atau penggunaan gaya sentrifugal yang terlalu kuat. (4) Filtrasi yang dipercepat: Saringan sel (misalnya, saringan dengan bukaan 70 μm atau 40 μm) digunakan untuk menyaring sampel sebelum sitometri aliran untuk menghilangkan gumpalan sel besar dan pengotor.
2. Antibodi atau pewarna berlabel fluoresen dapat menyebabkan pewarnaan yang tidak merata dan memengaruhi keandalan data, terutama dalam eksperimen multi-label.

Penyebab: langkah pewarnaan yang tidak tepat atau waktu yang terlalu singkat. Konsentrasi pewarna terlalu tinggi atau terlalu rendah. Kerusakan atau permeabilitas yang buruk selama pemrosesan sel. Solusi: (1) Optimalisasi kondisi pewarnaan: Sesuaikan konsentrasi dan waktu pewarnaan sesuai dengan manual reagen, dan biasanya pastikan reaksi pewarnaan berada dalam kisaran suhu dan waktu yang sesuai. (2) Gunakan langkah pencucian yang tepat: Setelah pewarnaan, hilangkan pewarna atau antibodi yang tidak terikat dengan pencucian yang memadai. (3) Gunakan pewarna yang tepat: Pilih pewarna dan antibodi yang sesuai dengan tujuan eksperimen untuk memastikan spesifisitas dan sensitivitasnya. Pra-eksperimen: Sebelum eksperimen formal, pra-eksperimen skala kecil dilakukan untuk mengoptimalkan kondisi pewarnaan dan konsentrasi pewarna.
3. Tingkat kebisingan latar belakang tinggi.

Penyebab: Pengikatan non-spesifik pewarna fluoresen. Terdapat sel atau partikel non-target dalam sampel. Pengaturan laser dan detektor yang tidak tepat. Kebisingan latar belakang yang tinggi akan memengaruhi akurasi hasil eksperimen, sehingga sulit untuk membedakan sinyal target dari sinyal latar belakang. Solusi: (1) Sesuaikan konsentrasi pewarna fluoresen: hindari penggunaan pewarna fluoresen yang berlebihan dan kurangi pengikatan non-spesifik. (2) Optimalkan pemilihan antibodi: Gunakan antibodi afinitas tinggi untuk mengurangi sinyal latar belakang. (3) Gunakan sampel kontrol: Evaluasi sinyal latar belakang dengan kontrol negatif, kontrol isotipe untuk membantu membedakan antara sinyal spesifik dan kebisingan latar belakang. (4) Kalibrasi laser dan filter: Pastikan pengaturan laser dan filter instrumen sudah benar dan minimalkan dampak kebisingan latar belakang.
4. Seleksi antibodi dan reaksi silang: Dalam eksperimen pelabelan ganda, reaksi silang antara antibodi yang berbeda dapat terjadi, sehingga menyulitkan interpretasi data.

Penyebab: Reaktivitas silang antara antibodi yang dipilih secara tidak tepat atau antibodi berlabel fluoresen. Spektrum emisi pewarna tumpang tindih. Solusi: (1) Pilih antibodi dengan spesifisitas tinggi: Gunakan antibodi terverifikasi dengan afinitas tinggi untuk memastikan spesifisitasnya. (2) Hindari tumpang tindih pewarna: Pilih pewarna fluoresen dengan spektrum emisi yang berbeda untuk menghindari tumpang tindih sinyal antara pewarna yang berbeda. (3) Gunakan urutan pelabelan yang tepat: Urutan pelabelan antibodi diatur secara wajar sesuai dengan urutan spektrum eksitasi dan emisi pewarna fluoresen.

referensi

[1] McKinnon KM. Flow Cytometry: An Overview. Curr Protoc Immunol. 2018;120:5.1.1-5.1.11. Diterbitkan 21 Februari 2018. doi:10.1002/cpim.40

[2] Givan AL. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 2011;699:1-29. doi:10.1007/978-1-61737-950-5_1

[3] Nolan JP, Condello D. Sitometri aliran spektral. Curr Protoc Cytom. 2013; Bab 1:1.27.1-1.27.13. doi:10.1002/0471142956.cy0127s63

[4] Maciorowski Z, Chattopadhyay PK, Jain P. Sitometri Aliran Multikolor Dasar. Curr Protoc Immunol. 2017;117:5.4.1-5.4.38. Diterbitkan 3 April 2017. doi:10.1002/cpim.26

[5] Darzynkiewicz Z, Bedner E, Smolewski P. Flow cytometry dalam analisis siklus sel dan apoptosis. Semin Hematol. 2001;38(2):179-193. doi:10.1016/s0037-1963(01)90051-4