Protokol dan Pertanyaan yang Sering Diajukan (FAQ) tentang Hibridisasi In Situ Fluoresensi

Hibridisasi in situ fluoresensi (FISH) adalah teknik biologi molekuler yang digunakan untuk mendeteksi dan melokalisasi lokasi sekuens asam nukleat spesifik (seperti DNA atau RNA) dalam sel atau potongan jaringan. Teknologi ini banyak digunakan dalam penelitian genomik, sitologi, dan patologi, terutama dalam lokalisasi gen, analisis kelainan kromosom, dan deteksi ekspresi gen.

Prinsip Ikan

Probe asam nukleat berlabel fluoresensi digunakan untuk berhibridisasi dengan sekuens DNA atau RNA target dalam sampel sel atau jaringan untuk menemukan dan mendeteksi sekuens asam nukleat spesifik pada tingkat molekuler. FISH adalah teknik yang sangat sensitif dan sangat spesifik yang dapat secara akurat mengidentifikasi dan menampilkan lokasi gen atau RNA target dalam sel atau potongan jaringan.

Langkah-langkah Eksperimen FISH (fluorescence in situ hybridization)

Persiapan Sampel

Sebelum eksperimen FISH dimulai, sampel, biasanya berupa potongan sel atau jaringan, perlu disiapkan.

Persiapan sel atau jaringan

Pilih sampel sel atau jaringan yang sesuai, sumber umum meliputi darah, potongan jaringan, kultur sel, dll. Sampel perlu mempertahankan struktur spasial aslinya agar urutan target dapat ditemukan secara akurat.

Fiksasi

Menggunakan reagen kimia (seperti formaldehida, asam asetat glasial, dll.) untuk memfiksasi sampel. Tujuan imobilisasi adalah untuk menjaga sel atau jaringan dalam sampel dalam keadaan struktural aslinya untuk mencegah degradasi sel atau asam nukleat. Metode fiksasi yang umum digunakan adalah: fiksasi formaldehida 4%, fiksasi asam asetat glasial, dll.

Penetrasi

Setelah sampel difiksasi, agar probe dapat menembus sel atau jaringan, penetrasi biasanya diperlukan. Permeabilizer yang umum digunakan meliputi Triton X-100, Saponin, dan lain-lain. Reagen ini dapat menghancurkan membran sel dan memungkinkan probe asam nukleat masuk ke dalam sel.

Perlakuan pemanasan awal (opsional)

Dalam beberapa kasus, sampel mungkin perlu menjalani perlakuan denaturasi termal untuk memisahkan untai ganda DNA, yang memfasilitasi pengikatan probe ke sekuens target.

Desain dan Pelabelan Probe

Desain probe

Probe FISH biasanya berupa asam nukleat untai tunggal pendek (DNA atau RNA) yang menargetkan sekuens DNA atau RNA. Probe ini harus memiliki tingkat spesifisitas yang tinggi dan dapat komplementer dengan sekuens target. Sesuai dengan kebutuhan eksperimen, desain probe perlu mempertimbangkan spesifisitas, panjang, dan stabilitas gen atau sekuens target.

Pelabelan probe

Untuk memvisualisasikan probe dalam percobaan, probe biasanya diberi label dengan pewarna fluoresen. Pewarna pelabelan fluoresen yang umum digunakan adalah FITC (hijau), Cy3 (merah), seri Alexa Fluor, dll. Pelabelan probe dapat berupa pelabelan langsung (menghubungkan molekul fluoresen di ujung probe) atau pelabelan tidak langsung (menggunakan biotin atau penanda lain, dan kemudian menggunakan pelabelan antibodi sekunder).

Hibridisasi

Persiapan larutan hibridisasi

Probe berlabel dicampur dengan buffer hibridisasi, biasanya menggunakan buffer yang mengandung konsentrasi garam dan pelarut organik yang sesuai, seperti SSC (buffer garam-natrium sitrat) atau buffer Hybe. Pastikan suhu, konsentrasi garam, dan nilai pH larutan hibridisasi sesuai untuk pengikatan probe ke sekuens target.

Penambahan probe

Larutan probe berlabel ditambahkan ke sampel (seperti potongan jaringan atau sel). Pada saat ini, probe akan berhibridisasi dengan sekuens DNA atau RNA target, dan hibridisasi biasanya dilakukan pada suhu yang lebih tinggi (seperti 37 °C hingga 55 °C). Suhu spesifik disesuaikan berdasarkan kandungan GC probe dan karakteristik sekuens target. Biasanya, waktu hibridisasi adalah beberapa jam hingga semalaman.

Pencucian

Hilangkan pengikatan non-spesifik

Setelah reaksi hibridisasi selesai, sampel perlu dicuci untuk menghilangkan probe yang tidak terikat secara spesifik dan mengurangi sinyal latar belakang. Proses pencucian biasanya meliputi pencucian dengan buffer rendah garam (seperti 2 × SSC), dan suhu dapat diatur ke suhu ruangan atau sedikit lebih tinggi untuk menghilangkan probe yang terikat secara tidak spesifik.

Sinyal yang ditingkatkan

Dalam beberapa kasus, langkah-langkah peningkatan juga dapat digunakan, seperti penggunaan antibodi sekunder berlabel antibodi atau reagen peningkatan fluoresensi, untuk lebih meningkatkan intensitas dan spesifisitas sinyal.

Deteksi dan Pengamatan Sinyal

Pengamatan mikroskop fluoresensi

Setelah dicuci, sampel dapat diamati dengan mikroskop fluoresensi ketika sudah siap. Mikroskop menggunakan filter yang sesuai untuk mengeksitasi pewarna fluoresen yang diberi label pada probe dan menangkap sinyal fluoresensi yang dipancarkan. Pewarna fluoresen yang berbeda memiliki panjang gelombang emisi yang berbeda, sehingga beberapa urutan target dapat dideteksi secara bersamaan dengan memilih kombinasi filter yang berbeda.

Fotografi dan analisis

Sinyal fluoresensi di bawah mikroskop menunjukkan lokasi sekuens DNA atau RNA target. Data eksperimen dapat disimpan dengan memotret gambar tersebut, dan lokasi, jumlah, atau pola ekspresi sekuens target dapat dianalisis lebih lanjut.

Pemrosesan Akhir dan Analisis Data

Analisis gambar

Analisis kuantitatif citra fluoresensi dilakukan menggunakan perangkat lunak analisis citra (seperti ImageJ, Metamorph, dll.) untuk mengevaluasi kekuatan sinyal, lokasi sinyal, dll. Hal ini sangat penting untuk lokalisasi gen, analisis ekspresi gen, dan lokalisasi sinyal ganda dalam berbagai eksperimen FISH.

Penjelasan hasil

Berdasarkan lokasi dan intensitas sinyal fluoresensi, distribusi gen atau RNA target dalam sel atau jaringan dianalisis. Misalnya, menganalisis lokasi kromosom gen, distribusi spasial ekspresi gen, atau perbedaan genetik antara sampel yang berbeda.

Gambar 1. Diagram skematik dari keseluruhan proses cardioFISH. (Sumber referensi: Protokol hibridisasi in situ fluoresensi untuk kardiomiosit.)

Jenis-Jenis Probe FISH yang Umum

Probe DNA

Digunakan untuk mendeteksi sekuens DNA, biasanya digunakan untuk analisis lokalisasi kromosom. Jumlah, struktur, dan lokalisasi gen pada kromosom dapat dianalisis dengan menggunakan probe DNA.

Probe RNA

Digunakan untuk mendeteksi molekul RNA spesifik, biasanya untuk analisis ekspresi gen. Melalui probe RNA, tingkat ekspresi gen spesifik dapat dilokalisasi dan dikuantifikasi dalam sel atau jaringan.

Probe FISH Multiplex

Beberapa sekuens target dapat dideteksi secara simultan dengan menggunakan probe berlabel fluoresen dengan warna berbeda. Aplikasi multi-probe ini dapat secara efektif meningkatkan efisiensi eksperimen dan membantu peneliti untuk mengamati informasi lokalisasi beberapa gen atau RNA secara bersamaan.

Spesifisitas dan Sensitivitas Teknik FISH

Kekhususan

Spesifisitas FISH berasal dari komplementaritas antara probe dan sekuens target. Hibridisasi hanya dapat berhasil jika probe sepenuhnya cocok dengan sekuens target. Desain probe perlu dipilih sesuai dengan keunikan dan redundansi sekuens target untuk menghindari hibridisasi non-spesifik.

Kepekaan

FISH dapat mendeteksi sekuens target dengan kelimpahan rendah karena probe berlabel dapat mengikat sekuens target secara efisien dan dapat mendeteksi sinyal yang sangat lemah melalui amplifikasi sinyal fluoresensi. Hal ini memungkinkan FISH digunakan tidak hanya untuk analisis genomik skala besar, tetapi juga untuk lokalisasi gen dan deteksi ekspresi pada tingkat sel tunggal atau subseluler.

Alpha Lifetech memiliki pengalaman proyek bertahun-tahun, yang dapat melayani berbagai kebutuhan pelanggan dengan lebih baik. Alpha Lifetech menyediakan layanan deteksi hibridisasi in situ fluoresensi (FISH) untuk mendeteksi dan melokalisasi sekuens DNA atau RNA spesifik dalam sampel sel atau jaringan. FISH menggunakan probe berlabel fluoresen yang mengikat sekuens komplementer untuk memungkinkan penanda gen, kromosom, atau RNA spesifik divisualisasikan di bawah mikroskop fluoresensi.

Pertanyaan yang Sering Diajukan (FAQ)

1. Dalam percobaan FISH, sinyal fluoresensi dapat dipengaruhi oleh pengikatan non-spesifik, yang mengakibatkan sinyal latar belakang terlalu kuat dan memengaruhi keakuratan hasil.

(1). Kontrol ketat kondisi hibridisasi: pastikan suhu, konsentrasi garam, nilai pH, dan kondisi lain dari larutan hibridisasi memenuhi persyaratan pengikatan probe dan sekuens target. Suhu hibridisasi yang terlalu rendah dapat menyebabkan probe mengikat sekuens non-target, sehingga meningkatkan sinyal latar belakang. (2). Optimalkan langkah pencucian: Gunakan kondisi pencucian yang sesuai (seperti konsentrasi garam yang lebih tinggi dari buffer SSC) untuk menghilangkan probe pengikat non-spesifik dan mengurangi sinyal latar belakang. Suhu selama pencucian biasanya diatur pada suhu kamar atau sedikit lebih tinggi untuk secara efektif menghilangkan probe yang tidak terikat. (3). Tingkatkan waktu pencucian secara selektif: perpanjang waktu pencucian dan tingkatkan jumlah pencucian untuk memastikan penghapusan probe pengikat non-spesifik. (4). Pemblokiran antibodi: Sampel diblokir dengan reagen pemblokir (seperti BSA atau protamin) untuk mengurangi pengikatan non-spesifik.
2. Sinyal fluoresensi lemah atau sinyal tidak dapat diamati, sehingga menghasilkan hasil eksperimen yang tidak jelas.

(1) Meningkatkan konsentrasi probe: Jika sinyal terlalu lemah, konsentrasi probe dapat ditingkatkan atau waktu hibridisasi dapat diperpanjang, sehingga probe dapat mengikat sekuens target secara lebih sempurna. (2) Meningkatkan intensitas fluoresensi pewarna fluoresen: Pilih pewarna fluoresen yang lebih kuat (seperti seri Alexa Fluor, Cy5, dll.), atau gunakan antibodi sekunder untuk meningkatkan sinyal. (3) Optimalisasi kondisi hibridisasi: Kondisi seperti konsentrasi garam dan nilai pH larutan hibridisasi dioptimalkan untuk memastikan pengikatan probe ke sekuens target lebih efisien. (4) Meningkatkan jumlah probe berlabel: Untuk beberapa percobaan FISH, jika sinyal lemah, Anda dapat mempertimbangkan untuk meningkatkan jumlah probe fluoresen yang berbeda untuk meningkatkan intensitas sinyal setiap target.
3. Probe tersebut mengikat secara non-spesifik pada sekuens non-target, sehingga menghasilkan hasil yang tidak akurat.

(1) Meningkatkan suhu hibridisasi: Meningkatkan suhu reaksi hibridisasi dapat meningkatkan pengikatan spesifik probe ke sekuens target dan mengurangi pengikatan non-spesifik. Pemilihan suhu bergantung pada kandungan GC probe. Biasanya, suhu harus dioptimalkan sesuai dengan suhu annealing (nilai Tm) probe. (2) Mengoptimalkan desain probe: Pastikan bahwa sekuens desain probe sangat spesifik dan hindari pemasangan komplementer dengan sekuens non-target lainnya. (3) Menggunakan kondisi pencucian yang tepat: Tingkatkan ketelitian langkah pencucian, dan gunakan konsentrasi buffer garam yang lebih tinggi (seperti 2 × SSC) untuk menghilangkan probe yang terikat secara non-spesifik.
4. Probe gagal memasuki sel atau jaringan secara efektif, sehingga mengakibatkan kegagalan percobaan.

(1) Sel permeabel: Sampel diberi perlakuan dengan zat permeabilisasi yang sesuai (seperti Triton X-100, Saponin, dll.) untuk memastikan bahwa probe dapat menembus membran sel secara efektif. Waktu dan konsentrasi permeasi harus sesuai untuk menghindari kerusakan sel. (2) Optimalisasi kondisi permeabilisasi: Jenis sel atau jaringan yang berbeda mungkin memerlukan zat permeabilisasi atau kondisi permeabilisasi yang berbeda untuk menguji berbagai metode permeabilisasi guna memastikan efek masuknya probe yang terbaik.
5. Probe gagal berhibridisasi dengan sekuens DNA atau RNA target, sehingga mengakibatkan kegagalan eksperimen.

(1) Desain probe yang dioptimalkan: Pastikan urutan probe cukup komplementer dengan urutan target, dan pilih panjang yang sesuai (biasanya 20-50 pasangan basa) untuk meningkatkan efisiensi hibridisasi. (2) Sesuaikan kondisi hibridisasi: Sesuaikan suhu hibridisasi dan konsentrasi garam sesuai dengan kandungan GC dari urutan target, sehingga probe dapat mengikat urutan target secara efektif. Untuk urutan dengan kandungan GC yang lebih tinggi, diperlukan suhu hibridisasi yang lebih tinggi. (3) Perpanjang waktu hibridisasi: Tingkatkan waktu hibridisasi, terutama untuk urutan target dengan kelimpahan rendah, hibridisasi semalaman dapat dipertimbangkan untuk memastikan pengikatan yang cukup.

referensi

[1] Bayani J, Squire JA. Hibridisasi Fluoresensi in situ (FISH). Curr Protoc Cell Biol. 2004; Bab 22:. doi:10.1002/0471143030.cb2204s23

[2] Chrzanowska NM, Kowalewski J, Lewandowska MA. Penggunaan Hibridisasi In Situ Fluoresensi (FISH) dalam Diagnosis dan Terapi yang Disesuaikan pada Tumor Padat. Molecules. 2020;25(8):1864. Diterbitkan 17 April 2020. doi:10.3390/molecules25081864

[3] Gozzetti A, Le Beau MM. Hibridisasi in situ fluoresensi: penggunaan dan keterbatasan. Semin Hematol. 2000;37(4):320-333. doi:10.1016/s0037-1963(00)90013-1

[4] Jiang J. Hibridisasi in situ fluoresensi pada tanaman: perkembangan terkini dan aplikasi masa depan. Chromosome Res. 2019;27(3):153-165. doi:10.1007/s10577-019-09607-z

[5] Yao Z, Bai L, Nie Y. Protokol hibridisasi in situ fluoresensi untuk kardiomiosit. J Mol Cell Cardiol. Diterbitkan secara online 13 Februari 2025. doi:10.1016/j.yjmcc.2025.02.003