Protokol Hibridisasi Fluoresensi In Situ dan FAQ

Hibridisasi fluoresensi in situ (FISH) adalah teknik biologi molekuler yang digunakan untuk mendeteksi dan menentukan lokasi urutan asam nukleat tertentu (seperti DNA atau RNA) dalam sel atau bagian jaringan. Teknologi ini banyak digunakan dalam penelitian genomik, sitologi, dan patologi, terutama dalam penentuan lokasi gen, analisis kelainan kromosom, dan deteksi ekspresi gen.

Prinsip FISH

Probe asam nukleat berlabel fluoresensi digunakan untuk melakukan hibridisasi dengan urutan DNA atau RNA target dalam sampel sel atau jaringan untuk menemukan dan mendeteksi urutan asam nukleat tertentu pada tingkat molekuler. FISH merupakan teknik yang sangat sensitif dan sangat spesifik yang dapat mengidentifikasi dan menampilkan lokasi gen atau RNA target secara akurat dalam sel atau bagian jaringan.

Tahapan Percobaan FISH (Fluoresensi In Situ Hibridisasi)

Persiapan Sampel

Sebelum percobaan FISH dimulai, sampel, biasanya bagian sel atau jaringan, perlu disiapkan.

Persiapan sel atau jaringan

Pilih sampel sel atau jaringan yang tepat. Sumber yang umum termasuk darah, potongan jaringan, kultur sel, dll. Sampel harus mempertahankan struktur spasial asli agar dapat menemukan urutan target secara akurat.

Fiksasi

Menggunakan reagen kimia (seperti formaldehida, asam asetat glasial, dll.) untuk memfiksasi sampel. Tujuan imobilisasi adalah untuk menjaga sel atau jaringan dalam sampel dalam keadaan struktur aslinya untuk mencegah degradasi sel atau asam nukleat. Metode fiksasi yang umum digunakan adalah: fiksasi formaldehida 4%, fiksasi asam asetat glasial, dll.

Penetrasi

Setelah sampel difiksasi, agar probe dapat menembus ke dalam sel atau jaringan, biasanya diperlukan penetrasi. Permeabilizer yang umum digunakan meliputi Triton X-100, Saponin, dll. Reagen ini dapat menghancurkan membran sel dan memungkinkan probe asam nukleat memasuki sel.

Perlakuan pemanasan awal (opsional)

Dalam beberapa kasus, sampel mungkin perlu menjalani perawatan denaturasi termal untuk membuka untai ganda DNA, yang memfasilitasi pengikatan probe ke urutan target.

Desain dan Pelabelan Probe

Desain probe

Probe FISH biasanya berupa asam nukleat untai tunggal pendek (DNA atau RNA) yang menargetkan sekuens DNA atau RNA. Probe ini harus memiliki tingkat spesifisitas yang tinggi dan dapat melengkapi sekuens target. Menurut kebutuhan percobaan, desain probe perlu mempertimbangkan spesifisitas, panjang, dan stabilitas gen atau sekuens target.

Pelabelan probe

Untuk memvisualisasikan probe dalam percobaan, probe biasanya diberi label dengan pewarna fluoresens. Pewarna penanda fluoresens yang umum digunakan adalah FITC (hijau), Cy3 (merah), seri Alexa Fluor, dll. Pelabelan probe dapat berupa pelabelan langsung (menghubungkan molekul fluoresens di ujung probe) atau pelabelan tidak langsung (menggunakan biotin atau penanda lain, dan kemudian menggunakan pelabelan antibodi sekunder).

Hibridisasi

Persiapan larutan hibridisasi

Probe berlabel dicampur dengan buffer hibridisasi, biasanya menggunakan buffer yang mengandung konsentrasi garam dan pelarut organik yang sesuai, seperti SSC (buffer garam-natrium sitrat) atau buffer Hybe. Pastikan bahwa suhu, konsentrasi garam, dan nilai pH larutan hibridisasi sesuai untuk pengikatan probe ke urutan target.

Penambahan probe

Larutan probe berlabel ditambahkan ke sampel (seperti potongan jaringan atau sel). Pada saat ini, probe akan berhibridisasi dengan urutan DNA atau RNA target, dan hibridisasi biasanya dilakukan pada suhu yang lebih tinggi (seperti 37 °C hingga 55 °C). Suhu spesifik disesuaikan menurut kandungan GC dari probe dan karakteristik urutan target. Biasanya, waktu hibridisasi adalah beberapa jam hingga semalam.

Pencucian

Hapus pengikatan non-spesifik

Setelah reaksi hibridisasi selesai, sampel perlu dicuci untuk menghilangkan probe tanpa ikatan spesifik dan mengurangi sinyal latar belakang. Proses pencucian biasanya meliputi pencucian dengan buffer rendah garam (seperti 2 × SSC), dan suhu dapat diatur ke suhu ruangan atau sedikit lebih tinggi untuk menghilangkan probe yang tidak terikat secara spesifik.

Sinyal yang ditingkatkan

Dalam beberapa kasus, langkah-langkah peningkatan juga dapat digunakan, seperti penggunaan antibodi sekunder berlabel antibodi atau reagen peningkatan fluoresensi, untuk lebih meningkatkan intensitas dan spesifisitas sinyal.

Deteksi dan Observasi Sinyal

Pengamatan mikroskop fluoresensi

Setelah dicuci, sampel dapat diamati dengan mikroskop fluoresensi saat sampel sudah siap. Mikroskop menggunakan filter yang sesuai untuk membangkitkan pewarna fluoresensi yang tertera pada probe dan menangkap sinyal fluoresensi yang dipancarkan. Pewarna fluoresensi yang berbeda memiliki panjang gelombang emisi yang berbeda, sehingga beberapa urutan target dapat dideteksi secara bersamaan dengan memilih kombinasi filter yang berbeda.

Fotografi dan analisis

Sinyal fluoresensi di bawah mikroskop menunjukkan lokasi urutan DNA atau RNA target. Data eksperimen dapat disimpan dengan memotret gambar, dan lokasi, jumlah, atau pola ekspresi urutan target dapat dianalisis lebih lanjut.

Pascaproses dan Analisis Data

Analisis gambar

Analisis kuantitatif citra fluoresensi dilakukan menggunakan perangkat lunak analisis citra (seperti ImageJ, Metamorph, dll.) untuk mengevaluasi kekuatan sinyal, lokasi sinyal, dll. Hal ini sangat penting untuk pelokalan gen, analisis ekspresi gen, dan pelokalan beberapa sinyal dalam berbagai eksperimen FISH.

Penjelasan hasil

Berdasarkan lokasi dan intensitas sinyal fluoresensi, distribusi gen atau RNA target dalam sel atau jaringan dianalisis. Misalnya, menganalisis lokasi kromosom gen, distribusi spasial ekspresi gen, atau perbedaan genetik antara sampel yang berbeda.

Gambar 1. Diagram skematik dari keseluruhan proses cardioFISH. (Sumber referensi:Protokol hibridisasi fluoresensi in situ untuk kardiomiosit.)

Jenis-jenis Probe FISH yang Umum

Pemeriksaan DNA

Digunakan untuk mendeteksi urutan DNA, biasanya digunakan untuk analisis lokasi kromosom. Jumlah, struktur, dan lokasi gen kromosom dapat dianalisis dengan probe DNA.

Pemeriksaan RNA

Digunakan untuk mendeteksi molekul RNA tertentu, biasanya untuk analisis ekspresi gen. Melalui pemeriksaan RNA, tingkat ekspresi gen tertentu dapat dilokalisasi dan diukur dalam sel atau jaringan.

Probe FISH Multipleks

Beberapa urutan target dapat dideteksi secara bersamaan dengan menggunakan probe berlabel fluoresensi dengan warna yang berbeda. Aplikasi beberapa probe ini dapat secara efektif meningkatkan efisiensi eksperimen dan membantu peneliti untuk mengamati informasi lokalisasi beberapa gen atau RNA pada saat yang bersamaan.

Spesifisitas dan Sensitivitas Teknik FISH

Kekhususan

Spesifisitas FISH berasal dari komplementaritas antara probe dan urutan target. Hibridisasi dapat berhasil hanya jika probe sepenuhnya cocok dengan urutan target. Desain probe perlu dipilih sesuai dengan keunikan dan redundansi urutan target untuk menghindari hibridisasi yang tidak spesifik.

Kepekaan

FISH dapat mendeteksi sekuens target dengan kelimpahan rendah karena probe berlabel dapat mengikat sekuens target secara efisien dan dapat mendeteksi sinyal yang sangat lemah melalui amplifikasi sinyal fluoresensi. Hal ini memungkinkan FISH digunakan tidak hanya untuk analisis genomik skala besar, tetapi juga untuk lokalisasi gen dan deteksi ekspresi pada tingkat sel tunggal atau subselular.

Alpha Lifetech memiliki pengalaman bertahun-tahun dalam proyek, yang dapat melayani berbagai kebutuhan pelanggan dengan lebih baik. Alpha Lifetech menyediakan layanan deteksi hibridisasi fluoresensi in situ (FISH) untuk mendeteksi dan melokalisasi urutan DNA atau RNA tertentu dalam sampel sel atau jaringan. FISH menggunakan probe berlabel fluoresensi yang mengikat urutan komplementer untuk memungkinkan penanda gen, kromosom, atau RNA tertentu divisualisasikan di bawah mikroskop fluoresensi.

Tanya Jawab Umum

1. Dalam percobaan FISH, sinyal fluoresensi dapat dipengaruhi oleh pengikatan non-spesifik, sehingga menghasilkan sinyal latar belakang yang terlalu kuat dan memengaruhi keakuratan hasil.

(1). Kontrol ketat kondisi hibridisasi: pastikan bahwa suhu, konsentrasi garam, nilai pH dan kondisi lain dari larutan hibridisasi memenuhi persyaratan pengikatan probe dan urutan target. Suhu hibridisasi yang terlalu rendah dapat menyebabkan probe mengikat urutan non-target, sehingga meningkatkan sinyal latar belakang. (2). Optimalkan langkah pencucian: Gunakan kondisi pencucian yang tepat (seperti konsentrasi garam buffer SSC yang lebih tinggi) untuk menghilangkan probe pengikat non-spesifik dan mengurangi sinyal latar belakang. Suhu selama pencucian biasanya diatur pada suhu kamar atau sedikit lebih tinggi untuk menghilangkan probe yang tidak terikat secara efektif. (3). Tingkatkan waktu pencucian secara selektif: perpanjang waktu pencucian dan tingkatkan jumlah pencucian untuk memastikan penghilangan probe pengikat non-spesifik. (4). Pemblokiran antibodi: Sampel diblokir dengan reagen pemblokiran (seperti BSA atau protamin) untuk mengurangi pengikatan non-spesifik.
2. Sinyal fluoresensi lemah atau sinyal tidak dapat diamati, sehingga hasil eksperimen tidak jelas.

(1) Meningkatkan konsentrasi probe: Jika sinyal terlalu lemah, konsentrasi probe dapat ditingkatkan atau waktu hibridisasi dapat diperpanjang, sehingga probe dapat mengikat urutan target lebih penuh. (2) Meningkatkan intensitas fluoresensi pewarna fluoresensi: Pilih pewarna fluoresensi yang lebih kuat (seperti seri Alexa Fluor, Cy5, dll.), atau gunakan antibodi sekunder untuk meningkatkan sinyal. (3) Optimalisasi kondisi hibridisasi: Kondisi seperti konsentrasi garam dan nilai pH larutan hibridisasi dioptimalkan untuk memastikan bahwa pengikatan probe ke urutan target lebih efisien. (4) Meningkatkan jumlah probe berlabel: Untuk beberapa eksperimen FISH, jika sinyalnya lemah, Anda dapat mempertimbangkan untuk meningkatkan jumlah probe fluoresensi yang berbeda untuk meningkatkan intensitas sinyal setiap target.
3. Probe mengikat secara tidak spesifik ke urutan nontarget, sehingga menghasilkan hasil yang tidak akurat.

(1) Meningkatkan suhu hibridisasi: Meningkatkan suhu reaksi hibridisasi dapat meningkatkan pengikatan spesifik probe ke urutan target dan mengurangi pengikatan non-spesifik. Pilihan suhu bergantung pada kandungan GC dari probe. Biasanya, suhu harus dioptimalkan sesuai dengan suhu anil (nilai Tm) dari probe. (2) Mengoptimalkan desain probe: Pastikan bahwa urutan desain probe sangat spesifik dan hindari pemasangan komplementer dengan urutan non-target lainnya. (3) Gunakan kondisi pencucian yang sesuai: tingkatkan keketatan langkah pencucian, dan gunakan konsentrasi buffer garam yang lebih tinggi (seperti 2 × SSC) untuk menghilangkan probe yang terikat secara non-spesifik.
4. Probe gagal memasuki sel atau jaringan secara efektif, sehingga mengakibatkan kegagalan percobaan.

(1) Sel permeabel: Sampel diperlakukan dengan permeabilizer yang sesuai (seperti Triton X-100, Saponin, dll.) untuk memastikan bahwa probe dapat menembus membran sel secara efektif. Waktu dan konsentrasi permeasi harus sesuai untuk menghindari kerusakan sel. (2) Optimalisasi kondisi permeabilisasi: Jenis sel atau jaringan yang berbeda mungkin memerlukan permeabilizer atau kondisi permeabilisasi yang berbeda untuk menguji metode permeabilisasi yang berbeda guna memastikan efek masuknya probe terbaik.
5. Probe gagal melakukan hibridisasi dengan urutan DNA atau RNA target, sehingga mengakibatkan kegagalan percobaan.

(1) Desain probe yang dioptimalkan: Pastikan bahwa urutan probe cukup komplementer dengan urutan target, dan pilih panjang yang sesuai (biasanya 20-50 pasangan basa) untuk meningkatkan efisiensi hibridisasi. (2) Sesuaikan kondisi hibridisasi: sesuaikan suhu hibridisasi dan konsentrasi garam sesuai dengan kandungan GC dari urutan target, sehingga probe dapat secara efektif mengikat urutan target. Untuk urutan dengan kandungan GC yang lebih tinggi, diperlukan suhu hibridisasi yang lebih tinggi. (3) Perpanjang waktu hibridisasi: Tingkatkan waktu hibridisasi, terutama untuk urutan target dengan kelimpahan rendah, hibridisasi semalam dapat dipertimbangkan untuk memastikan pengikatan yang cukup.

referensi

[1] Bayani J, Squire JA. Hibridisasi Fluoresensi in situ (FISH). Curr Protoc Cell Biol. 2004; Bab 22:. doi:10.1002/0471143030.cb2204s23

[2] Chrzanowska NM, Kowalewski J, Lewandowska MA. Penggunaan Hibridisasi Fluoresensi In Situ (FISH) dalam Diagnosis dan Terapi Khusus pada Tumor Padat. Molekul. 2020;25(8):1864. Diterbitkan 17 April 2020. doi:10.3390/molecules25081864

[3] Gozzetti A, Le Beau MM. Hibridisasi fluoresensi in situ: penggunaan dan keterbatasan. Semin Hematol. 2000;37(4):320-333. doi:10.1016/s0037-1963(00)90013-1

[4] Jiang J. Hibridisasi fluoresensi in situ pada tanaman: perkembangan terkini dan aplikasi masa depan. Chromosome Res. 2019;27(3):153-165. doi:10.1007/s10577-019-09607-z

[5] Yao Z, Bai L, Nie Y. Protokol hibridisasi fluoresensi in situ untuk kardiomiosit. J Mol Cell Cardiol. Diterbitkan daring pada 13 Februari 2025. doi:10.1016/j.yjmcc.2025.02.003