Protokol dan Tanya Jawab Imunositokimia (ICC)

Imunositokimia (ICC) adalah teknik yang digunakan untuk mempelajari protein, antigen, atau biomolekul tertentu dalam sampel sel. Teknologi ICC menggabungkan spesifisitas dan reaksi warna antibodi, yang digunakan untuk menemukan dan mendeteksi ekspresi molekul intraseluler atau permukaan sel. Dengan menggunakan antibodi spesifik untuk mengikat penanda (seperti fluoresensi atau enzim), ICC dapat memberikan informasi lokalisasi sel beresolusi tinggi di bawah mikroskop, yang banyak digunakan dalam penelitian dasar, diagnosis penyakit, dan obat-obatan.

Prinsip Imunositokimia

Prinsip dasar ICC adalah pengikatan spesifik antibodi terhadap antigen targetnya (biasanya protein spesifik intraseluler atau permukaan sel). Visualisasikan distribusi dan ekspresi protein dengan fluoresensi, enzim, atau pelabelan kimia. Setiap antibodi adalah molekul yang menargetkan antigen spesifik dan mengikat ke daerah struktural antigen tertentu (biasanya epitop antigen). Ketika antibodi mengikat protein target, kompleks antigen-antibodi terbentuk. Kemudian kompleks antibodi-antigen dideteksi dengan pewarnaan atau pelabelan fluoresensi. Deteksi kompleks ini dapat diamati dengan mikroskop dan terlokalisasi di area sel tertentu. Penanda yang umum digunakan meliputi:

Pelabelan enzim (seperti horseradish peroxidase HRP): Reaksi warna terjadi setelah reaksi dengan substrat.

Pelabelan fluoresensi (seperti FITC, Cy3): Setelah eksitasi, fluoresensi dipancarkan untuk memfasilitasi pengamatan di bawah mikroskop fluoresensi.

Tahapan Imunositokimia

Persiapan Sampel-Kultur Sel

Sel-sel disemai pada cawan petri atau slide yang sesuai untuk memastikan perlekatan sel atau pertumbuhan suspensi. Sel-sel difiksasi dengan fiksatif yang sesuai (seperti paraformaldehida 4% atau metanol) untuk mempertahankan morfologi sel dan lokasi molekul target. Waktu fiksasi dan konsentrasi harus disesuaikan menurut jenis sel dan karakteristik protein target. Setelah itu, sel-sel perlu dipermeabilisasi. Permeasi adalah untuk memungkinkan antibodi menembus membran sel untuk mencapai bagian dalam sel. Permeabilizer yang umum digunakan termasuk 0,1% -0,5% Triton X-100 atau 0,1% Tween-20. Waktu permeasi umumnya 10-15 menit, disesuaikan sesuai kebutuhan. Situs pengikatan antibodi non-spesifik diblokir dengan larutan pemblokiran (seperti 5% serum kambing normal atau albumin serum sapi BSA). Waktu penutupan biasanya 30 menit hingga 1 jam, pada suhu kamar.

Inkubasi Antibodi

Antibodi primer (antibodi spesifik terhadap protein target) diencerkan dalam larutan pemblokiran dan ditambahkan ke sampel. Waktu inkubasi biasanya 1 jam hingga semalaman, dan suhu dapat disesuaikan menurut persyaratan eksperimen (biasanya suhu ruangan atau 4℃ semalaman). Jika antibodi sekunder digunakan, antibodi sekunder yang sesuai (seperti antibodi berlabel enzim atau berlabel fluoresensi) perlu dipilih menurut tujuan eksperimen.

Pencucian

Sampel dicuci dengan buffer PBS atau TBS untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Langkah pencucian biasanya diulang 3 kali, masing-masing selama 5-10 menit.

Inkubasi Antibodi Sekunder

Jika sistem antibodi primer-antibodi sekunder digunakan, maka antibodi sekunder yang mengandung penanda ditambahkan ke sampel. Antibodi sekunder mengikat antibodi primer dan memberikan sinyal yang dapat dideteksi (seperti fluoresensi atau enzim). Waktu inkubasi adalah 1 jam pada suhu ruangan.

Akhirnya Mencuci

Cuci sel lagi dengan PBS atau buffer TBS untuk menghilangkan kelebihan antibodi sekunder.

Deteksi Warna/Fluoresensi

Jika antibodi sekunder berlabel enzim (seperti HRP) digunakan, larutan substrat dapat ditambahkan, dan enzim bereaksi dengan substrat untuk menghasilkan reaksi warna yang terlihat.

Jika antibodi sekunder berlabel fluoresensi digunakan, sinyal berlabel dapat diamati langsung di bawah mikroskop fluoresensi.

Penyegelan

Gunakan larutan penyegel yang mengandung zat anti-pudar untuk menyegel film, mencegah pelemahan sinyal fluoresensi, dan melindungi sampel untuk pengamatan mikroskopis.

Pengamatan Mikroskopis

Sel-sel diamati melalui mikroskop optik atau mikroskop fluoresensi untuk menganalisis lokalisasi dan distribusi protein target dalam sel.

Catatan 1Pemilihan antibodi: Pemilihan antibodi yang tepat dan spesifik merupakan kunci keberhasilan percobaan ICC. Memastikan efektivitas dan spesifisitas antibodi dalam sel target.
Catatan 2Metode fiksasi: Fiksatif yang berbeda memiliki efek yang berbeda pada protein dan struktur sel. Memilih fiksatif yang tepat sangat penting untuk mempertahankan epitop antigen.
Catatan 3Pemilihan pelabelan fluoresensi/pelabelan enzim: pelabelan fluoresensi atau enzim dipilih sesuai dengan kebutuhan percobaan. Pelabelan fluoresensi cocok untuk berbagai percobaan pelabelan, dan pelabelan enzim cocok untuk deteksi kromogenik.

Gambar 1. Kontrol penyerapan adalah inkubasi antibodi primer dengan antigen yang digunakan untuk menghasilkan antibodi. (A) Antibodi primer yang diinkubasi dengan antigen berlebih mengikat semua situs Fab yang mampu mengikat antigen dalam jaringan (panah). (B) Jika antigen yang benar dan antigen yang salah memiliki epitop yang sama (panah), maka pengikatan keduanya dihambat oleh kontrol penyerapan. (C) Dalam beberapa kasus, antigen yang diserap oleh antibodi mengikat protein dalam jaringan, dan antibodi yang diserap tampaknya mengikat protein. (Sumber referensi:Kontrol untuk Imunositokimia.)

Keuntungan Imunositokimia

Spesifisitas tinggi: dapat mendeteksi protein spesifik, terutama untuk lokalisasi dan kuantifikasi protein.

Resolusi tingkat sel: Lokalisasi subseluler protein intraseluler dapat diamati.

Analisis kuantitatif dan kualitatif: Dikombinasikan dengan perangkat lunak analisis gambar, tingkat ekspresi protein dapat diukur dan perubahan distribusi protein dalam kondisi yang berbeda dapat dianalisis.

Aplikasi Imunositokimia

Lokalisasi Protein

Lokalisasi protein tertentu dalam sel (misalnya, membran sel, sitoplasma atau nukleus).

Pemeriksaan Narkoba

ICC dapat digunakan untuk mengamati efek obat pada molekul atau struktur sel tertentu, memberikan dukungan untuk pengembangan obat.

Penelitian Penyakit

Imunositokimia sering digunakan untuk mengamati ekspresi dan distribusi protein terkait penyakit pada kanker, penyakit neurodegeneratif, dan penelitian lainnya.

Alpha Lifetech menyediakan layanan Imunositokimia (ICC), mematuhi permintaan pelanggan yang berorientasi, mengandalkan platform teknologi canggih, dan menyediakan layanan ilmiah yang komprehensif dan disesuaikan untuk memastikan kelancaran kemajuan dan penyelesaian proyek berkualitas tinggi.

Tanya Jawab Umum

1. Sinyal lemah atau tidak ada sinyal.

Penyebab : (1) Kualitas antibodi buruk : Antibodi yang digunakan mungkin tidak terlalu spesifik atau tidak efektif. (2) Konsentrasi antibodi tidak tepat : Konsentrasi antibodi yang terlalu rendah atau terlalu tinggi dapat menyebabkan sinyal lemah atau derau latar belakang. (3) Masalah proses fiksasi : Jika sel tidak terfiksasi dengan baik, protein target dapat kehilangan kemampuan deteksinya. (4) Penetrasi yang buruk : Membran sel mungkin tidak cukup permeabel, sehingga antibodi tidak dapat memasuki sel. Solusi : (1) Gunakan antibodi berkualitas tinggi dan tervalidasi. (2) Konsentrasi disesuaikan menurut petunjuk antibodi, dan eksperimen gradien konsentrasi dilakukan. (3) Pilih agen fiksasi yang tepat (seperti formaldehida 4%) dan pastikan waktu dan suhu fiksasi sesuai. (4) Jika Anda perlu memberi label protein di dalam sel, gunakan penetran yang tepat (seperti Triton X-100 0,1%) untuk meningkatkan permeabilitas membran sel.
2. Sinyal latar belakang tinggi.

Penyebab: (1) Pengikatan non-spesifik: Antibodi dapat mengikat molekul non-target lain di dalam sel. (2) Masalah antibodi sekunder: Kualitas antibodi sekunder tidak baik atau tidak sesuai dengan jenis sel. (3) Pencucian yang tidak memadai: Antibodi tidak sepenuhnya tercuci, sehingga menghasilkan peningkatan sinyal latar belakang. Solusi: (1) Tingkatkan langkah pemblokiran dengan menggunakan larutan pemblokiran yang sesuai (seperti 5% bovine serum albumin atau serum kambing normal). Pilih antibodi sekunder yang sesuai dan pastikan bahwa antibodi tersebut cocok dengan spesies antibodi primer. (2) Lebih banyak buffer pencucian digunakan pada langkah pencucian untuk memastikan bahwa antibodi dan zat pengikat non-spesifik telah sepenuhnya dihilangkan.
3. Hilangnya atau rusaknya morfologi sel.

Penyebab: (1) Langkah fiksasi yang tidak tepat: Fiksasi yang berlebihan atau tidak mencukupi dapat menyebabkan perubahan atau hilangnya morfologi sel. (2) Penggunaan penetran yang tidak tepat: Penetran yang terlalu banyak atau terlalu kuat akan merusak struktur sel. Solusi: (1) Pastikan langkah fiksasi dilakukan sesuai standar, biasanya menggunakan formaldehida 4% atau fiksatif lain yang sesuai. (2) Hindari terlalu banyak penetran, sesuaikan konsentrasi penetran atau gunakan jenis penetran yang berbeda.
4. Pewarnaan tidak merata.

Penyebab: (1) Distribusi sel tidak merata: perlakuan sampel tidak seragam, distribusi sel mungkin tidak merata. (2) Waktu pewarnaan tidak tepat: waktu pewarnaan terlalu pendek atau terlalu lama, sehingga pewarnaan tidak merata. Solusi: (1) Pastikan sel-sel dilapisi secara merata pada slide. (2) Waktu pewarnaan dan waktu inkubasi antibodi dioptimalkan untuk memastikan reaksi yang seragam.
5. Spesifisitas antibodi.

Penyebab: Antibodi dapat bereaksi silang dengan protein nontarget di sel lain. Solusi: Antibodi yang diverifikasi digunakan dan kontrol positif dan negatif yang sesuai dilakukan. Coba gunakan antibodi lain atau antibodi pra-adsorpsi untuk mengurangi pengikatan nonspesifik.

referensi

[1] Maxwell P, Salto-Tellez M. Validasi imunositokimia sebagai teknik morfomolekuler. Cancer Cytopathol. 2016;124(8):540-545. doi:10.1002/cncy.21692

[2] Kanber Y, Pusztaszeri M, Auger M. Imunositokimia untuk diagnostik sitopatologi-Panduan praktis. Sitopatologi. 2021;32(5):562-587. doi:10.1111/cyt.12993

[3] Jain D, Bubendorf L. Imunositokimia dalam sitologi: mitos atau kenyataan. Acta Cytol. Diterbitkan online 30 Januari 2025. doi:10.1159/000543867

[4] Happonen RP, Heikenheimo K. Pengantar imunositokimia. Proc Finn Dent Soc. 1989;85(2):61-67.

[5] Skoog L, Tani E. Imunositokimia: teknik yang sangat diperlukan dalam sitologi rutin. Sitopatologi. 2011;22(4):215-229. doi:10.1111/j.1365-2303.2011.00887.x

[6] Burry RW. Kontrol untuk imunositokimia: pembaruan. J Histochem Cytochem. 2011;59(1):6-12. doi:10.1369/jhc.2010.956920