Protokol dan FAQ Imunositokimia (ICC)

Imunositokimia (ICC) adalah teknik yang digunakan untuk mempelajari protein, antigen, atau biomolekul spesifik lainnya dalam sampel sel. Teknologi ICC menggabungkan spesifisitas dan reaksi warna antibodi, yang digunakan untuk menemukan dan mendeteksi ekspresi molekul intraseluler atau permukaan sel. Dengan menggunakan antibodi spesifik untuk mengikat penanda (seperti fluoresensi atau enzim), ICC dapat memberikan informasi lokalisasi sel beresolusi tinggi di bawah mikroskop, yang banyak digunakan dalam penelitian dasar, diagnosis penyakit, dan pengobatan.

Prinsip Imunositokimia

Prinsip dasar ICC adalah pengikatan spesifik antibodi terhadap antigen targetnya (biasanya protein spesifik intraseluler atau permukaan sel). Visualisasikan distribusi dan ekspresi protein melalui fluoresensi, enzim, atau pelabelan kimia. Setiap antibodi adalah molekul yang menargetkan antigen spesifik dan berikatan dengan wilayah struktural spesifik antigen (biasanya epitop antigen). Ketika antibodi berikatan dengan protein target, kompleks antigen-antibodi terbentuk. Kemudian, kompleks antibodi-antigen dideteksi melalui pewarnaan atau pelabelan fluoresensi. Deteksi kompleks ini dapat diamati dengan mikroskop dan terlokalisasi di area spesifik sel. Penanda yang umum digunakan meliputi:

Pelabelan enzim (seperti horseradish peroxidase HRP): Reaksi warna terjadi setelah reaksi dengan substrat.

Pelabelan fluoresensi (seperti FITC, Cy3): Setelah eksitasi, fluoresensi dipancarkan untuk memfasilitasi pengamatan di bawah mikroskop fluoresensi.

Tahapan Imunositokimia

Persiapan Sampel-Kultur Sel

Sel-sel disemai pada cawan petri atau slide yang sesuai untuk memastikan perlekatan sel atau pertumbuhan suspensi. Sel-sel difiksasi dengan fiksatif yang sesuai (seperti paraformaldehida 4% atau metanol) untuk mempertahankan morfologi sel dan lokasi molekul target. Waktu fiksasi dan konsentrasi harus disesuaikan dengan jenis sel dan karakteristik protein target. Setelah itu, sel-sel perlu dipermeabilisasi. Permeasi adalah untuk memungkinkan antibodi menembus membran sel untuk mencapai bagian dalam sel. Permeabilizer yang umum digunakan termasuk 0,1% -0,5% Triton X-100 atau 0,1% Tween-20. Waktu permeasi umumnya 10-15 menit, disesuaikan sesuai kebutuhan. Situs pengikatan antibodi non-spesifik diblokir dengan larutan pemblokiran (seperti 5% serum kambing normal atau albumin serum sapi BSA). Waktu penutupan biasanya 30 menit hingga 1 jam, pada suhu kamar.

Inkubasi Antibodi

Antibodi primer (antibodi spesifik terhadap protein target) diencerkan dalam larutan penghambat dan ditambahkan ke sampel. Waktu inkubasi biasanya 1 jam hingga semalaman, dan suhu dapat disesuaikan sesuai kebutuhan eksperimen (biasanya suhu ruangan atau 4℃ semalaman). Jika antibodi sekunder digunakan, antibodi sekunder yang sesuai (seperti antibodi berlabel enzim atau berlabel fluoresen) perlu dipilih sesuai dengan tujuan eksperimen.

Pencucian

Sampel dicuci dengan PBS atau buffer TBS untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Tahap pencucian biasanya diulang 3 kali, masing-masing selama 5-10 menit.

Inkubasi Antibodi Sekunder

Jika sistem antibodi primer-antibodi sekunder digunakan, antibodi sekunder yang mengandung penanda ditambahkan ke sampel. Antibodi sekunder mengikat antibodi primer dan menghasilkan sinyal yang dapat dideteksi (seperti fluoresensi atau enzim). Waktu inkubasi adalah 1 jam pada suhu ruangan.

Akhirnya Mencuci

Cuci sel lagi dengan buffer PBS atau TBS untuk menghilangkan antibodi sekunder yang berlebih.

Deteksi Warna/Fluoresensi

Jika antibodi sekunder berlabel enzim (seperti HRP) digunakan, larutan substrat dapat ditambahkan, dan enzim bereaksi dengan substrat untuk menghasilkan reaksi warna yang terlihat.

Jika antibodi sekunder berlabel fluoresensi digunakan, sinyal berlabel dapat diamati langsung di bawah mikroskop fluoresensi.

Penyegelan

Gunakan larutan penyegel yang mengandung agen anti-pudar untuk menyegel film, mencegah pelemahan sinyal fluoresensi, dan melindungi sampel untuk pengamatan mikroskopis.

Pengamatan Mikroskopis

Sel-sel diamati melalui mikroskop optik atau mikroskop fluoresensi untuk menganalisis lokalisasi dan distribusi protein target dalam sel.

Catatan 1Pemilihan antibodi: Memilih antibodi yang tepat dan spesifik adalah kunci keberhasilan eksperimen ICC. Pastikan efektivitas dan spesifisitas antibodi dalam sel target.
Catatan 2 Metode fiksasi: Fiksatif yang berbeda memiliki efek yang berbeda terhadap protein dan struktur sel. Pemilihan fiksatif yang tepat sangat penting untuk mempertahankan epitop antigen.
Catatan 3 Pemilihan pelabelan fluoresensi/pelabelan enzim: pelabelan fluoresensi atau enzim dipilih sesuai kebutuhan percobaan. Pelabelan fluoresensi cocok untuk berbagai percobaan pelabelan, dan pelabelan enzim cocok untuk deteksi kromogenik.

Gambar 1. Kontrol absorpsi adalah inkubasi antibodi primer dengan antigen yang digunakan untuk menghasilkan antibodi. (A) Antibodi primer yang diinkubasi dengan antigen berlebih mengikat semua situs Fab yang mampu mengikat antigen di jaringan (panah). (B) Jika antigen yang benar dan antigen yang salah memiliki epitop yang sama (panah), maka pengikatan keduanya dihambat oleh kontrol absorpsi. (C) Dalam beberapa kasus, antigen yang diserap oleh antibodi mengikat protein di jaringan, dan antibodi yang diserap tampak mengikat protein. (Sumber referensi: Kontrol untuk Imunositokimia.)

Keuntungan Imunositokimia

Spesifisitas tinggi: dapat mendeteksi protein spesifik, terutama untuk lokalisasi dan kuantifikasi protein.

Resolusi tingkat sel: Lokalisasi subseluler protein intraseluler dapat diamati.

Analisis kuantitatif dan kualitatif: Dikombinasikan dengan perangkat lunak analisis gambar, tingkat ekspresi protein dapat diukur dan perubahan distribusi protein dalam kondisi berbeda dapat dianalisis.

Aplikasi Imunositokimia

Lokalisasi Protein

Lokalisasi protein spesifik dalam sel (misalnya, membran sel, sitoplasma atau nukleus).

Skrining Narkoba

ICC dapat digunakan untuk mengamati efek obat pada molekul atau struktur sel tertentu, memberikan dukungan untuk pengembangan obat.

Penelitian Penyakit

Imunositokimia sering digunakan untuk mengamati ekspresi dan distribusi protein terkait penyakit pada kanker, penyakit neurodegeneratif, dan penelitian lainnya.

Alpha Lifetech menyediakan layanan Imunositokimia (ICC), mematuhi permintaan pelanggan yang berorientasi, mengandalkan platform teknologi canggih, dan menyediakan layanan ilmiah yang komprehensif dan disesuaikan untuk memastikan kemajuan yang lancar dan penyelesaian proyek berkualitas tinggi.

Tanya Jawab Umum

1. Sinyal lemah atau tidak ada sinyal.

Penyebab: (1) Kualitas antibodi buruk: Antibodi yang digunakan mungkin tidak terlalu spesifik atau tidak efektif. (2) Konsentrasi antibodi yang tidak tepat: konsentrasi antibodi yang terlalu rendah atau terlalu tinggi dapat menyebabkan sinyal lemah atau noise latar belakang. (3) Masalah proses fiksasi: Jika sel tidak terfiksasi dengan baik, protein target dapat kehilangan kemampuan deteksinya. (4) Penetrasi yang buruk: Membran sel mungkin tidak cukup permeabel, sehingga antibodi tidak dapat memasuki sel. Solusi: (1) Gunakan antibodi berkualitas tinggi dan tervalidasi. (2) Konsentrasi disesuaikan menurut instruksi antibodi, dan eksperimen gradien konsentrasi dilakukan. (3) Pilih agen fiksasi yang tepat (seperti formaldehida 4%) dan pastikan waktu dan suhu fiksasi sesuai. (4) Jika Anda perlu memberi label protein di dalam sel, gunakan penetran yang sesuai (seperti Triton X-100 0,1%) untuk meningkatkan permeabilitas membran sel.
2. Sinyal latar belakang tinggi.

Penyebab: (1) Pengikatan non-spesifik: Antibodi dapat berikatan dengan molekul non-target lain di dalam sel. (2) Masalah antibodi sekunder: Kualitas antibodi sekunder tidak baik atau tidak sesuai dengan jenis sel. (3) Pencucian yang tidak memadai: Antibodi tidak tercuci sepenuhnya, sehingga menghasilkan peningkatan sinyal latar belakang. Solusi: (1) Tingkatkan langkah pemblokiran dengan menggunakan larutan pemblokiran yang sesuai (seperti albumin serum sapi 5% atau serum kambing normal). Pilih antibodi sekunder yang sesuai dan pastikan cocok dengan spesies antibodi primer. (2) Lebih banyak buffer pencucian digunakan pada langkah pencucian untuk memastikan antibodi dan zat pengikat non-spesifik terbuang sepenuhnya.
3. Hilangnya atau rusaknya morfologi sel.

Penyebab: (1) Tahap fiksasi yang tidak tepat: Fiksasi yang berlebihan atau tidak memadai dapat menyebabkan perubahan atau hilangnya morfologi sel. (2) Penggunaan penetran yang tidak tepat: Penetran yang terlalu banyak atau terlalu kuat akan merusak struktur sel. Solusi: (1) Pastikan tahap fiksasi dilakukan sesuai standar, biasanya menggunakan formaldehida 4% atau fiksatif lain yang sesuai. (2) Hindari penggunaan penetran yang terlalu banyak, sesuaikan konsentrasi penetran, atau gunakan jenis penetran yang berbeda.
4. Pewarnaan tidak merata.

Penyebab: (1) Distribusi sel tidak merata: perlakuan sampel tidak seragam, distribusi sel mungkin tidak merata. (2) Waktu pewarnaan yang tidak tepat: waktu pewarnaan terlalu pendek atau terlalu lama, sehingga menghasilkan pewarnaan yang tidak merata. Solusi: (1) Pastikan sel terlapisi secara merata pada slide. (2) Waktu pewarnaan dan waktu inkubasi antibodi dioptimalkan untuk memastikan reaksi yang seragam.
5. Spesifisitas antibodi.

Penyebab: Antibodi dapat bereaksi silang dengan protein non-target di sel lain. Solusi: Antibodi yang terverifikasi digunakan dan kontrol positif dan negatif yang sesuai dilakukan. Coba gunakan antibodi lain atau antibodi pra-adsorpsi untuk mengurangi ikatan nonspesifik.

referensi

[1] Maxwell P, Salto-Tellez M. Validasi imunositokimia sebagai teknik morfomolekular. Cancer Cytopathol. 2016;124(8):540-545. doi:10.1002/cncy.21692

[2] Kanber Y, Pusztaszeri M, Auger M. Imunositokimia untuk sitopatologi diagnostik-Panduan praktis. Sitopatologi. 2021;32(5):562-587. doi:10.1111/cyt.12993

[3] Jain D, Bubendorf L. Imunositokimia dalam sitologi: mitos atau kenyataan. Acta Cytol. Diterbitkan daring 30 Januari 2025. doi:10.1159/000543867

[4] Happonen RP, Heikenheimo K. Pengantar imunositokimia. Proc Finn Dent Soc. 1989;85(2):61-67.

[5] Skoog L, Tani E. Imunositokimia: teknik yang sangat diperlukan dalam sitologi rutin. Sitopatologi. 2011;22(4):215-229. doi:10.1111/j.1365-2303.2011.00887.x

[6] Burry RW. Kontrol untuk imunositokimia: pembaruan. J Histochem Cytochem. 2011;59(1):6-12. doi:10.1369/jhc.2010.956920